Aβ25～35海马注射对大鼠海马硫化氢/胱硫醚β－合酶体系的影响

陈 涛 贾 佳 周发明 周少华※

阿尔茨海默病(AD)是临床上常见的神经变性疾病，以脑实质细胞外基质中β淀粉蛋白(Aβ)沉积物积聚和脑内大量神经原纤维缠结为主要特征。Aβ具有神经毒性，可以引起神经元细胞凋亡及死亡，出现神经退行性变性临床症状。H2S是一种新发现的气体信号分子，有重要的生理功能，其中可能参与了AD发病机制中炎症、细胞凋亡、氧化性损伤等多种病理过程［1，2］。有研究显示外源性给予H2S可以对抗Aβ的细胞毒性，但Aβ对内源性H2S的影响却未见报道［3］。本研究希望通过测定大鼠海马组织中硫化氢含量、CBS的活性，探讨进Aβ海马注射对大鼠脑内源性硫化氢产生的影响，为AD的病理生理机制研究提供理论依据。

1.材料与方法

1.1 实验分组与模型制备

1.1.1 分组:成年 SD雄性大鼠 24只(体重250～300g)，购自湖北医药学院实验动物中心。经Morris水迷宫(购自中国医学科学院)测试判定其空间辨别性学习记忆能力，剔除反应过于迟钝或特别敏感的大鼠，将选出的大鼠随机分为生理盐水(NS)组和AD组，后者分Aβ25～35注射2周组AD(2W)、4周组AD(4W)，每组各8只。

1.1.2 模型制备与给药:AD组双侧海马区注射点(AP–3.5mm，ML ±2.0mm，DV2.7mm)分别注射 5μl(10μg)Aβ25～35，NS组则注射等量的生理盐水。术后给予青霉素钠2万单位肌注防治感染。

1.2 标本制作与保存 在时间点麻醉大鼠，断头取脑后在冰面上迅速分离大鼠双侧海马，冰生理盐水中漂洗后用滤纸吸干，置入0.5m l trizol的EP管中保存在－80℃冰箱备用。

1.3 海马H2S含量的测定 参照采用文献［4］所述的方法。取0.1m l海马组织匀浆，加入0.5ml 1%的乙酸锌，然后分别加入0.5ml 20mmol/LN，N－二甲基对苯二胺盐酸盐和0.5ml30mmol/L的三氯化铁(FeCl3)，室温静置10分钟后，再加入0.5ml10%三氯乙酸(Cl3-C-COOH)及2.5ml蒸馏水，混匀后，4000r/min，离心10分钟。取上清，利用分光光度计在670nm处，读取光密度值。根据硫氢化钠标准曲线，计算各个样本中H2S浓度。

1.4 海马中CBS酶活性的测定 参照文献［5］取海马匀浆1ml与100mmol/L pH 7.4的磷酸钾缓冲液、10nmol/L L－半胱氨酸、2mmol/L 5－磷酸吡哆醛加入25ml锥形瓶中进行反应。在中央室中加入1% 的0.5ml醋酸锌，放入滤纸增加吸收面积。用氮气将锥形瓶充盈30秒后石蜡膜封口，转移到37℃水浴摇床中开始反应，90分钟后向其中注入0.5ml的50%Cl3-C-COOH中止反应，继续水浴60分钟后向中央室内加入50μl的N，N－二甲基对苯二胺盐酸盐(20mmol/L)/氯化氢(HCl 7.2mol/L)缓冲液及50μl FeCl3(30mmol/L)/氯化氢(HCl1.2mol/L)缓冲液。充分混匀。20分钟后，用全自动酶标仪在波长670nm测定吸光度，根据H2S标准曲线计算溶液中H2S浓度，组织中CBS活性以单位重量的脑组织在单位时间内生成H2S的量【nmol/(g·h)/】表示。

2.结果

如表1所示。AD(2W)和AD(4W)组同NS组比较，海马H2 S浓度明显降低(P＜0.01)，而AD(2W)组与AD(4W)组比较，海马H2 S浓度差异无统计学意义(P＞0.05)。但AD(2W)组和AD(4W)组同NS组比较，海马CBS活性却显著增强(P＜0.05)，AD(2W)组与AD(4W)组比较，海马H2 S浓度差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 三组大鼠海马H2 S含量及CBS活性(±s)

表1 三组大鼠海马H2 S含量及CBS活性(±s)

注:＊P ＜0.01 vs NS，#P ＞0.05 vs AD(2W)。

项目 N NS组 AD(2W)组 AD(4W)组H2 S(nmol/g) 8 38.67±4.23 21.39±3.82* 18.31±3.46*#CBS【nmol/(g·h)/】 8 45.32 ±6.23 54.13 ±6.71* 59.29 ±7.25*#

3.讨论

随着人口老龄化，AD给社会带来了沉重的压力，已经引起了全世界的关注。AD患者的脑神经元周围可以看到大量的Aβ沉积，Aβ25～35是Aβ片段中的主要毒性成分，可以引起氧化应激和神经元凋亡，同时在Aβ免疫反应沉积处也存在着大量营养不良性轴突，Aβ沉积可能是导致神经元变性和突触丢失的重要原因［6～8］，以上可能是引起AD的重要病理机制。研究显示，硫化氢(H2S)广泛存在于哺乳动物的多种组织器官中，具有多种生理功能，并且与NO、CO这两种气体分子在部分生物学功能方面相同或相似，参与许多神经系统疾病的病理生理过程。

通过采用对各组大鼠海马组织H2S进行测定，我们观察到，发现AD 2周和4周组与NS组比较，血浆及海马组织H2S含量均明显降低，提示Aβ25～35注射可引起大鼠体内H2S水平显著降低，这一作用在2周就较明显，至少持续4周。氧化应激是Aβ沉积参与AD的重要机制。而H2S可以清除过氧亚硝酸盐，提升细胞内谷胱甘肽的浓度以及激活ATP依赖性的K+和Cl－通道发挥抗氧化损伤作用［9］。同时，H2S是一种还原剂，容易与H2O2反应，因此H2S可直接清除ROS，从而发挥神经保护作用［10，11］。此外，内源性H2S作为一种神经递质，可以通过升高神经细胞内环磷酸腺苷水平，增强脑N－甲基－D－天门冬氨酸(NMDA)受体调节的反应，增加NMDA受体介导的突触后兴奋性电位，从而诱导CA1区海马长时程增强(LTP)的产生［12］。内源性H2S减少，可使其诱导产生的LTP减少，这可能是引起AD认知功能障碍的一个重要机制。

本实验还发现，AD 2周和4周组与NS组比较，但海马CBS表达显著增加，提示在AD大鼠模型中内源性H2S与CBS之间可能存在负反馈调节作用。而H2S还对CSE和CBS具有负反馈调节作用已在近期的研究中证实［13，14］。具体的机制值得进一步研究。

综上可知，内源性H2S与CBS可能参与了Aβ25～35诱导的AD发生与发展过程。我们相信随着深入研究H2S与CBS体系在AD的作用，将会给AD的防治带来新的思路。

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