姜黄素对低氧诱导的HaCaT细胞增殖以及HIF-1α蛋白的影响*

于春水 苏江维 胡 珍

（川北医学院附属医院，四川 南充 637000）

姜黄素（curcumin）是从姜科植物姜黄中提取的一种酚类物质。动物实验表明，姜黄素具有抗氧化、抗感染、抗炎及抑制肿瘤生长等作用［1］。国外学者研究发现，姜黄素能够抑制膀胱癌T24细胞增殖，阻止该细胞在G2-M期，其作用呈浓度依赖性，同时姜黄素还具有下调T24细胞的细胞周期蛋白A（cyclinA），上调细胞周期素依赖激酶抑制剂P21 WAF1/CIP1，降低环氧酶-2 mRNA及其蛋白表达的作用［2］。本研究将不同浓度的姜黄素作用于培养的HaCaT细胞，观察其对HaCaT细胞增殖及在缺氧培养下对HaCaT细胞中低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）蛋白表达的影响，探讨姜黄素对HaCaT细胞增殖及HIF-1α的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 HaCaT细胞株（武汉大学典型物保藏中心），HIF-1α兔抗人单克隆抗体（Sigma公司）。姜黄素（Sigma公司），纯度＞96%，用DMSO稀释，等量分装，-20℃保存。用时用培养液稀释为 0.1%（v/v），以不影响细胞的生长。

1.2 姜黄素对HaCaT细胞增殖抑制的检测 （MTT法） HaCaT细胞以DMEM培养基常规培养，每2～3日换液、传代。取对数期生长的HaCaT细胞，以1.0×104/mL接种于96孔培养板中，每孔100 μL，24 h 后弃培养液，处理组细胞分别加入 10、20、30 μmol/L的姜黄素，每孔100 μL，对照组仅用DMEM处理，每孔均为100μL，设3个复孔。常规设立对照组，加入与姜黄素等体积的培养液于对照组内。于培养24 h时，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL）孵育4 h，弃上清，然后每孔加入 DMSO 100 μL，沉淀充分溶解后，用酶标仪测定570 nm波长下OD值，生长抑制率＝（1-实验组OD值/空白组OD值）×100%。

1.3 HaCaT细胞的缺氧处理与免疫组化检测 将HaCaT细胞的单细胞混悬液以每孔1×104的密度小心接种至放有盖玻片的6孔板内，然后每孔加入2.0 mL的DMEM培养液。培养条件为：50 U/mL 青霉素，50 mg/mL 链霉素，1.25 mg/mL 两性霉素 B，于37℃，5%CO2的孵箱内培养。待细胞长至60%融合时，再将细胞置于 37℃，含有1%O2，5%CO2和94%N2的缺氧培养箱中继续培养24 h。之后，处理组细胞分别加入终浓度为10、20、30 μmol/L的姜黄素，每孔 2000 μL，对照组仅用 DMEM处理，培养48 h后取出盖玻片做随后的实验，每组均设3个复孔。在用姜黄素处理HaCaT细胞时，保持避光。HIF-1α蛋白在HaCaT细胞的检测，实验结束，取出上述盖玻片，按照常规免疫组化操作步骤进行，阳性细胞为有棕黄色颗粒状沉淀。免疫组化结果采用德国LeicaQ570公司的图像分析仪及图像分析系统软件对其进行半定量分析，每张盖玻片随机选取3个视野，每个视野选取10个细胞测量其平均灰度值，图像分为0～255灰度级，染色结果越淡，灰度值越高。

2 结 果

2.1 不同浓度的姜黄素对HaCaT细胞增殖的影响 见表1。姜黄素对HaCaT细胞增殖有抑制作用，随着药物浓度的增加，抑制作用加强，并呈显著的量效依赖型关系。

表1 不同浓度姜黄素对HaCaT细胞增殖的影响（n=3，±s）

表1 不同浓度姜黄素对HaCaT细胞增殖的影响（n=3，±s）

与对照组比较，*P＜0.01。 下同。

组 别 OD值对照组 1.234±0.03姜黄素 10 μmol/L 组 0.532±0.05*姜黄素 20 μmol/L 组 0.454±0.04*姜黄素 30 μmol/L 组 0.408±0.02*

2.2 HaCaT细胞缺氧培养后HIF-1α蛋白表达比较 HaCaT细胞在缺氧培养后，HIF-1α蛋白的免疫组化着色在对照组呈阳性表达（图1）；而在姜黄素处理后，HaCaT细胞中HIF-1α蛋白的表达减少，同时随着姜黄素浓度的增加，HaCaT细胞中HIF-1α蛋白的表达逐渐减弱，染色显示，阳性主要位于细胞的胞浆内。姜黄各组与对照组比较，有显著差异（P＜0.01），并且灰度分析的结果与光学显微镜的观察结果相一致（表2）。

图1 各组HaCaT细胞缺氧培养后HIF-1α蛋白表达（×200）

表2 姜黄素对HaCaT细胞中HIF-1α蛋白表达影响（n=3，±s）

表2 姜黄素对HaCaT细胞中HIF-1α蛋白表达影响（n=3，±s）

组 别 灰度值对照组 131.12±3.21姜黄素 10 μmol/L 组 192.13±3.13*姜黄素 20 μmol/L 组 201.16±2.14*姜黄素 30 μmol/L 组 240.13±4.15*

3 讨 论

有研究发现，姜黄素可抑制体内外肿瘤细胞的生长，因此，姜黄素在防治肿瘤等方面有明显的作用，其良好的抗突变和抗癌作用使其成为一种很有应用前景的抗癌药物［3］。而银屑病角质形成细胞的异常增殖在某种程度上与肿瘤细胞的表现类似。

HIF-1α是HIF-1异源二聚体结构之一，属于bHLH-PAS家族成员。有研究报道，HIF-1α在银屑病皮损中的表皮角质形成细胞及其真皮乳头层毛细血管内皮细胞中呈过度表达［4］。近来的研究显示，在缺氧情况下，HIF-1α在HaCaT细胞的表达增高［5］。

本研究结果显示，以不同浓度的姜黄素作用于HaCaT细胞后均能抑制培养的HaCaT细胞增殖，并且结果呈现量效依赖关系，同时，随着姜黄素浓度的增加其抑制作用增强，该结果与对照组相比具有显著差异 （P＜0.01）；姜黄素能抑制缺氧培养的HaCaT细胞HIF-1α蛋白的表达，并呈量效依赖关系，与对照组相比，有显著差异（P＜0.01）。有研究认为，银屑病皮损区可能存在局域缺氧［6］，银屑病皮损表皮HIF-1α表达增高，认为可能与皮损局部缺氧有关［7］。因此，缺氧培养的HaCaT细胞与银屑病、肿瘤细胞的情况有些类似。

有研究报道，HIF-1α与胸腺瘤的发生有关系［8］。银屑病和恶性肿瘤都表现为具有特征性的细胞过度增殖和局域性的缺氧表现［9］。本实验结果显示，姜黄素具有抑制HaCaT细胞的增殖及HIF-1α蛋白的表达的作用，如用于银屑病治疗中，可以改善银屑病表皮的异常增殖现象。因此，姜黄素可能对于表现为表皮异常增殖的一类疾病效果满意。在银屑病中局部表皮细胞的异常增殖增加了该处的氧的消耗，而棘层的肥厚可以进一步导致皮损处氧供应的障碍。有研究发现，在缺氧条件下，HaCaT细胞表达HIF-1α仅是蛋白水平的增加，而在mRNA水平其表达是稳定的［9］。这一结论与我们的研究结果相一致。姜黄素对HaCaT细胞中的HIF-1α mRNA具体作用如何，有待进一步深入的研究。由于HaCaT细胞在缺氧培养的条件下与银屑病表皮所处的情况有些类似，而本实验结果显示，姜黄素具有抑制缺氧培养的HaCaT细胞中HIF-1α蛋白表达的作用。因此，笔者认为，姜黄素可推荐用于银屑病以及表现为表皮异常增殖的一类疾病的治疗，使其异常增殖的表皮得以恢复正常。

［1］龙明智，陈磊磊.姜黄素的药理作用［J］.国外医学：中医中药分册，2003，25（5）：270-275.

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［3］许建华，赵蓉，柯丹如，等.姜黄素的体外抗癌作用及其水溶液的稳定性［J］.中药药理与临床，1998，14（5）：415-417.

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［5］Nys K，Van LA，Michiel C，et al.A p38 （MAPK）/HIF-1 pathway initiated by UVB irradiation is required to induce Noxa and apoptosis of human keratinocytes［J］.J Invest Dermatol，2010， 130（9）：2269-2276.

［6］Tovar LE，Cancino JC，Garsia VF，et al.Underexpression of VHL and over-expression of HDAC-1，HIF-l alpha，LL-37，and IAP-2 in affected skin biopsies of patients with psoriasis［J］.Int J Dermatol， 2007，46（3）：239-246.

［7］杨海龙，栗玉珍，孙瑞，等.HIF-1α、VEGF在银屑病皮损中的表达及意义［J］.医学信息，2011，24（1）：340-342.

［8］王湛，黄壮士，苏彦河，等.HIF-1α、Caspase-3及 Survivin在胸腺瘤中的表达及意义［J］.中华临床医师杂志：电子版，2009，3（5）：717-722.

［9］杨井，陶娟，李延，等.缺氧对 HaCaT细胞 HIF-1α、GLUT-1表达的影响及与细胞增殖的关系［J］.中国皮肤性病学杂志，2009，23（10）：621-623.