Tricine电泳优化方法在针灸效应小分子蛋白检测中的应用

尹磊淼,魏颖,王宇,冉君,刘晓燕,徐玉东,杨永清



Tricine电泳优化方法在针灸效应小分子蛋白检测中的应用

尹磊淼1,魏颖2,王宇1,冉君2,刘晓燕2,徐玉东1,杨永清2

(1.上海市针灸经络研究所,上海 200030;2.上海中医药大学,上海 201203)

改进一种适合分离、鉴定针灸效应小分子蛋白的Tricine-SDS-PAGE电泳体系。研究调整分离胶中聚丙烯酰胺浓度和凝胶交联度并加入适量甘油,从而优化Tricine电泳系统。与常规Glycine-SDS-PAGE电泳系统比较,分离胶聚丙烯酰胺浓度为l6.8%、交联度为5.8%、含10.4%甘油的Tricine-SDS-PAGE电泳明显减少10 kD分子量蛋白的弥散,成功分离了分子量为11.0 kD的S100A8和11.8 kD的S100A11等两个针刺抗哮喘小分子蛋白。优化的Tricine-SDS-PAGE电泳系统可有效分离针灸效应小分子蛋白。

针灸效应;物质基础研究;Tricine电泳;小分子蛋白

作为生命科学的分支之一,针灸学和分子生物学、神经生物学、系统生物学等学科相互交叉,相互推动,产生了针灸效应物质基础研究等一系列新的研究方向和领域[1,2]。针灸效应物质基础研究立足于生命现象的本质,研究不同针灸效应的响应基因和应答蛋白,阐释相应的针灸效应生物学机制。这对保持我国在针灸研究领域的国际领先地位,率先在针灸研究领域拥有原创性的自主知识产权具有重要的战略意义[3]。针灸效应物质基础研究常用技术手段有高效液相色谱[4],蛋白质双向电泳技术,基因芯片、基因表达连续分析(serial analysis of gene expression,SAGE)技术[5]等。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)因操作简便,测定快速,重复性好,上样量少等特点在针刺效应蛋白质的分离、分析、纯化、鉴定等实验中具有广泛的用途。SDS-PAGE电泳系统的有效分离范围取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度,并受尿素、甘油或蔗糖等可降低聚丙烯酰胺凝胶孔径的溶质分子影响;其次,调整和选择电泳缓冲液中拖尾离子的种类和浓度,也可以达到改善小分子蛋白质和多肽的分离效果[6,7]。

在前期研究中,我们课题组利用SAGE技术相继发现了双特异性磷酸酶1(DUSP-1)、金属硫蛋白-2 (MT-2)、S100钙结合蛋白A8(S100A8)和S100A11等一系列针刺抗哮喘效应蛋白[8]。然而MT-2、S100A8、S100A11等蛋白分子量较小,利用普通SDS-PAGE电泳常常难以获得较好的观察和分析结果。本研究拟调整聚丙烯酰胺的浓度和交联度,并适量增加甘油降低凝胶孔径,采用三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)作为拖尾离子,利用快速考马斯亮蓝染色方法,尝试建立了一种满足小分子量蛋白检测需要的电泳方法,从而配合其他分子生物学技术的开展,并为深入开展针灸效应物质基础研究提供可靠的实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

丙烯酰铵、甲叉双丙烯酰铵(Bis-Acrylamide)、过硫酸铵(APS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)等均购自美国Bio-Rad公司;Tricine、三羟甲基氨基甲烷(Tris)购自美国Amresco公司;甘油、盐酸(HCL)购自国药集团化学试剂有限公司;溴酚蓝购自上海升正生物技术有限公司;GelCode Blue Stain染色试剂购自美国Thermo Fisher Scientific公司。pHS-3TC(0.01级)精密数显pH计购自上海天达仪器有限公司;小型垂直电泳槽、Gel-Doc凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司;蛋白质分子量Marker购自MBI Fermentas公司。S100A8和S100A11蛋白由前期课题组通过基因表达和蛋白分离纯化技术所得。

1.2 溶液配制

1.2.1 凝胶储备液的配制

本研究中的Tricine电泳系统中共有两种不同浓度和交联度的凝胶贮存液,按配制称取不同重量的丙烯酰铵和甲叉双丙烯酰铵,将其溶于100 mL双蒸水,混匀,4℃保存。详见表1。

表1 Tricine-SDS-PAGE电泳凝胶储备液的配制

1.2.2 电泳缓冲液的配制

Tricine-SDS-PAGE电泳缓冲液共有两种,为电极缓冲液和凝胶缓冲液。电极缓冲液不同于常规SDS-PAGE电泳,其阳极缓冲液(即下牙槽缓冲液)仅由Tris盐组成,pH值较高,为8.90。阴极缓冲液(即上牙槽缓冲液)除Tris盐外,还有Tricine和SDS,pH值较低,为8.25。凝胶缓冲液包括分离胶和浓缩胶缓冲液,前者由3.0 M的Tris盐和0.3% SDS组成,pH值为8.90;后者仅含Tris盐,并用HCl将pH调至6.80。详见表2。

表2 Tricine-SDS-PAGE电泳缓冲液的配制

1.2.3 分离胶、成层胶和浓缩胶的配制

根据所需胶浓度配制如下溶液,混匀后均匀灌入组装好的电泳玻璃胶架中。利用水依次封闭各层胶面,当胶与水出现清晰界限时表明聚合已经完成。待胶聚合后用滤纸吸干水,继续下一层胶的灌制。详见表3。

表3 Tricine-SDS-PAGE电泳凝胶的配制

1.2.4 2×SDS上样缓冲液的配制

按要求配制2×SDS上样缓冲液,混匀后－20℃保存。详见表4。

表4 2×SDS上样缓冲液配制

1.3 蛋白上样、电泳参数和染色

在蛋白样品中加入2×SDS上样缓冲液,100℃煮沸5 min,均匀混合样品,使蛋白质与SDS充分结合。准备好电泳装置,外槽加入阳极电泳缓冲液,内槽加入阴极电泳缓冲液,利用上样细枪头将蛋白样品加入凝胶的点样孔中,恒压80 V,开始电泳。待指示带跑入分离胶时,更换为120 V恒定电压。电泳结束后取下电泳胶,利用快速考马斯亮蓝染色方法染色1 h。该染料只对蛋白质染色,不需要脱色,可以直接肉眼观察。待条带清晰显现后,扫描保存图片。

2 结果

2.1 浓度为l6.8%和交联度为5.8%分离胶的建立

分离胶是Tricine-SDS-PAGE电泳系统的主要载体,起着重要的分子筛作用,而分离胶的浓度在很大程度上直接决定着蛋白分离效果的优劣。分离胶浓度是指100 mg凝胶溶液中含有单体(丙烯酰胺)和交联剂(甲叉双丙烯酰铵)的总克数。不同浓度的分离胶通过控制凝胶孔径的大小,从而影响样品的分离效果。提高分离胶浓度,其对小分子蛋白的分离效果也随之提高。然而胶浓度并不是越高越好,当分离胶浓度提高到25.0%时,由于分离胶孔径太小,电泳反而受阻。通过比较,本实验确定分离胶浓度为16.8%。

交联度是指凝胶溶液中,交联剂(甲叉双丙烯酰铵)占单体(丙烯酰胺)和交联剂总量的百分数。合适的交联剂和单体比例很重要。为了制作富有弹性、透明的凝胶,通过比较,本实验确定分离胶交联度为5.8%。

2.2 SDS-PAGE电泳和Tricine-SDS-PAGE电泳结果比较

常规SDS-PAGE电泳难以有效浓缩、分辨10 kD左右的蛋白条带。在常规SDS-PAGE电泳图中,10 kD分子量条带无法得到有效浓缩,条带弥散(图1A箭头处所示),且相应蛋白条带模糊不清楚(图1A)。

Tricine-SDS-PAGE电泳采用Tricine代替甘氨酸作为尾随离子,通过16.8%分离胶、10.1%成层胶和6.6%浓缩胶的组合,利用10.4%甘油降低聚丙烯酰胺凝胶孔径,从而较好地浓缩了10 kD分子量条带(图1B、C箭头处所示),有效清晰地分离出分子量为11.0 kD的S100A8(图1B)和11.8 kD的S100A11(图1C)等两个针刺抗哮喘小分子蛋白。图中M为分子量Marker。

图1 SDS-PAGE电泳和Tricine-SDS-PAGE电泳结果比较图

3 讨论

针灸效应物质基础研究常借鉴蛋白质组学、基因组学等高通量方法从整体层面上观察和分析针灸效应响应基因、应答蛋白及其相互作用机制[9]。随着研究深入,发现越来越多的小分子蛋白在针刺抗哮喘效应物质研究和针刺预防1型糖尿病效应物质研究中起着至关重要的作用[8,10]。因此建立一种快速、有效的检测小分子蛋白方法,已成为实验研究体系不可缺少的组成部分之一。

SDS-PAGE电泳分辨率除了受浓缩胶和分离胶的浓度、交联度影响外,和缓冲液pH值,样品制备方法等密切相关[11]。但要想获得良好的小分子蛋白分辨率,首先就需要有效地对其进行浓缩。Schagger等利用Tricine-SDS-PAGE电泳系统成功地解决了分子量为1-100 kD蛋白的浓缩和分离问题[6]。本研究同样采用解离常数为8.15的Tricine代替解离常数较高的Glycine(甘氨酸,解离常数pK为9.6)作为尾随离子,可以使蛋白样品更好地被压缩。因为在浓缩胶中Tricine和Glycine均可跟随氯离子形成前后两条离子带,从而把上样蛋白压缩。Tricine解离常数小,和先导氯离子靠得更为接近,可以把蛋白压缩在更为狭窄的区域,其结果是对小分子蛋白质的浓缩更有效[12]。

Tricine-SDS-PAGE电泳系统较常规的SDS-PAGE系统相比,在浓缩胶和分离胶之间引入成层胶,其目的是使小分子蛋白质和多肽的条带更加尖锐,避免弥散和拖尾。此外,由于小分子蛋白对染料的结合能力较弱、易扩散、着色较差,还需要使用快速蛋白染色。

本研究采用Tricine作为尾随离子,构建浓度为l6.8%的分离胶、10.1%的成层胶和6.6%的浓缩胶,利用10.4%甘油降低聚丙烯酰胺凝胶孔径,优化了Tricine-SDS-PAGE电泳系统,清晰分离了S100A8, S100A11等针刺抗哮喘小分子蛋白,上样量小,重复性好。这为深入开展针灸效应物质基础研究奠定了良好的实验基础。

[1] 杨永清,尹磊淼,徐玉东,等.系统生物学与针灸学[J].上海针灸杂志,2009,28(10):616-619.

[2] 杨永清,陈汉平,王宇,等.针灸效应物质基础研究[J].上海针灸杂志,2006,25(2):4-6.

[3] 杨永清,王宇,刘艳艳,等.针灸效应物质基础研究与针灸作用原理研究[J].上海针灸杂志,2008,27(9):39-41.

[4] 王宇,马淑兰,崔建美,等.针刺抗哮喘大鼠血清差异组份的色谱分析[J].上海针灸杂志,2006,25(8):41-43.

[5] 尹磊淼,徐玉东,王宇,等.针刺正常大鼠肺组织SAGE标签数据库的基因分类研究[J].上海针灸杂志,2010,29(5):315-317.

[6] Schagger H. Tricine-SDS-PAGE[J]. Nat Protoc, 2006,1(1):16-22.

[7] LaemmLi UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970,227(5259):680-685.

[8] Yin LM, Jiang GH, Wang Y,. Use of serial analysis of gene expression to reveal the specific regulation of gene expression profile in asthmatic rats treated by acupuncture[J]. J Biomed Sci, 2009,16 (1):46.

[9] 陈汉平.刺灸诱生特异蛋白猜想[J].上海针灸杂志,2006,25(10): 1-2.

[10] Yin LM, Li HY, Zhang QH,. Effects of S100A9 in a rat model of asthma and in isolated tracheal spirals[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010,398(3):547-552.

[11] Judd RC. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Peptides. In Walker JM (eds) The Protein Protocols Handbook[M]. 2nd edn, Humana Press Inc, Totowa, NJ. 2002, chapter 13:73-79.

[12] Schagger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacry- lamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa[J]. Anal Biochem, 1987,166(2):368-379.

Application of Optimized Tricine Electrophoresis Method in Detecting Low Molecular Weight Proteins of Acupuncture Effect

-1,2,1,2,-2,-1,-2.

1.,200030,; 2.,201203,

To improve a Tricine-SDS-PAGE electrophoresis technology suitable for isolation and identification of low molecular weight proteins of acupuncture effect.Tricine electrophoresis system was optimized by adjusting polyacrylamide concentration and the crosslinking degree in separation gel and adding an appropriate amount of glycerol.Compared with conventional Glycine-SDS-PAGE electrophoresis system, Tricine-SDS-PAGE electrophoresis system containing separation gel with l6.8% polyacrylamide and 5.8% crosslinking degree, and 10.4% glycerol significantly reduced 10 kD protein dispersion and successfully isolated two low molecular weight anti-asthma proteins of acupuncture effect: S100A8 with molecular weight of 11.0 kD and S100A11 with molecular weight of 11.8 kD.The optimized Tricine-SDS-PAGE electrophoresis system can effectively isolate low molecular weight proteins of acupuncture effect.

Acupuncture effect; Material foundation research; Tricine electrophoresis; Low molecular weight protein

1005-0957(2012)03-0191-03

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2012.03.191

2011-11-23

国家自然科学基金(81001548,30873299,81173341, 81173332);上海市教委和上海市教育发展基金会“晨光计划”资助项目(10CG45);上海市卫生局青年基金(2009Y096);上海高校优秀青年教师科研基金(szy09022);上海市重点学科建设项目(S30304)

尹磊淼(1983 - ),男,助理研究员,博士,博士后,E-mail: collegeylm@163.com

杨永清(1964 - ),男,研究员,博士,E-mail:dryqyang@163. com