布-加综合征与F V Leiden及FIIG20210A突变关系探究

朱子清 李胜利 严文君 孙桂香 祖茂衡 陆召军

布加氏综合征（Budd-Chiari syndrome,BCS）是由多种原因引起的肝静脉或肝段下腔静脉部分或完全梗阻性肝静脉-下腔静脉血液回流障碍，导致瘀血性门静脉高压症和下腔静脉高压症两大综合征。它是以肝小静脉及下腔静脉与右心房静脉交汇处各段狭窄或阻塞而致肝静脉血流受阻失调为特征的总称。BCS可见于任何年龄，以青壮年和中老年多见，综合国内近20年来发表的文献BCS患者已经超过万余例[2]，居世界首位。该病在西方国家被认为主要是由血液的凝血系统及抗凝系统紊乱导致的血栓引起，有几种可能机制如凝血V因子Leiden突变、蛋白C缺乏、凝血酶原(FII)基因G20210A突变、抗凝血酶Ⅲ缺乏等。我们从国外多个研究中心最新的数据可以看出，原发性的BCS被认为是一种多病因导致的疾病，许多促凝因子的失调导致在这一极为不常见的位置形成血栓。在至少35%的患者中观察到其血栓形成率要比普通人群高[3]。本次研究从导致凝血机制和抗凝机制紊乱的基因层面—FV Leiden与FIIG20210A基因突变角度着手研究，现将研究结果报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集徐州医学院附属医院2008年10月～2010年7月在介入科住院治疗的布加综合征患者102例为研究对象，其中，男性58例（56.86%），女性44例（43.14%）；患者年龄18～67岁，平均46岁。所有患者均于治疗前抽取外周静脉血2ml。

1.2 入选标准

所有病例均首选彩色多普勒超声作为筛查手段，而后采用金标准下腔静脉造影（Seldinger法）或肝静脉造影及手术确诊为布加综合征。排除外伤致急性BCS患者、入院前因BCS出血而输血者及BCS合并肝癌者。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取及保存

抽取病例组及对照组肘正中静脉血2ml于真空采血管（EDTA-K2抗凝）中，-80oC超低温冰箱保存。应用全血DNA提取试剂盒对外周血进行DNA的提取（试剂盒由上海赛百盛基因技术有限公司生产），对提取后的DNA进行纯化。

1.3.2 AS-PCR 检测F V Leiden与FIIG20210A两个点突变

引物设计：FV Leiden和FIIG20210A基因在GeneBank中的序列号分别为HGNC:3542和HGNC:3535。参照文献[4]设计引物，包括一对外侧引物(forward primer，reverse prime)以扩增出基因第十外显子，即为体系验证引物内参，另外两条(specific primer)为特异突变点引物，两条特异性引物分别同内参引物组成反应体系进行AS-PCR。

表1 31物与对应序列

反应体系如下：取一0.2 mlPCR管，按下列次序加入以下物质：DNA模板100ng，forward primer 1μl，reverse primer 1μl，specific primer 1μl，10*PCR缓冲液(含MgCl2)5μl，dNTP5μl，5U/μl Taq酶1μl，补足去离子水31μl至总反应体积为50μl。

混匀管内混合物，滴入20～40 μl矿物油覆盖表面。将上述反应管放入PCR仪，按下列参数进行循环(the Hybaid Touch Down PCR assay,TD PCR): 94℃变性2min，1cycle；94℃变性20 s，66℃退火40 s，66℃延伸40 s，10cycles, 94℃变性20 s，62℃退火20 s，72℃延伸20s，20cycles；延伸72℃，2min。

反应完毕取出反应管，取出5ul样品进行琼脂糖电泳（1.5%浓度,EB染色）以鉴定片段大小,内对照为429bp，若存在阳性突变则特异突变点FV Leiden和FIIG20210A将会分别产生为234bp和145bp条带，将电泳后的凝胶进行成像处理。

2 结果

本次研究中的BCS病例组阻塞类型以下腔静脉型为主，占69.2%，混合型占24.62%，而肝静脉型最少，占13.8%，且以膜性阻塞为多数。与国内外已知研究结果相一致。提取的DNA经核酸蛋白检测仪测定，浓度值范围在(25.5773～59.2843)ug/ml区间，其吸光度OD260/OD280 值（即纯度值）范围在 1.5731～1.9653区间，符合AS-PCR的要求。经AS-PCR检测，102例BCS FV Leiden与FIIG20210A两位点，经琼脂糖凝胶电泳显示均为阴性，见图1。

图1 Factor V Leiden与FIIG20210A位点电泳图

3 讨论

AS-PCR又称为扩增阻滞突变系统(Amplification Refractory Mutation System,ARMS)通过设计寡核苷酸引物，使得这一引物仅仅与突变点相匹配而在PCR过程中扩增。ASPCR最大的优点是灵敏度高，其检测范围可达1%～3%。Jones等的实验也表明ARMS方法能够检测出其中只有1%～2%比例的突变点[5]。现在西方国家的许多实验室（如ARUP, Salt Lake City, UT; Oregon Medical Laboratories, Eugene, OR;and Rush Medical Laboratories, Chica-go,IL）都把以ASPCR方法为基础的检测用于临床检验目的。AS-PCR在目前可谓是一种简便可靠的基因检测方法。

由于凝血因子V(Factor V,FV)基因点突变（FV Leiden）所致的蛋白C（Protein C,PC）抗凝途径中抗活化的蛋白C（Activated Protein C Resistance,APCR）现象是引起静脉血栓（Venous Thrombosis,VT）的主要原因，但FV Leiden 突变的发生率在不同种族的人群中存在明显差异，在欧洲白种人群中具有高发性。凝血酶原(FII)是一种在肝细胞中合成的维生素K依赖性蛋白质，其水平高于1.15U/ml者较正常者血栓形成危险增加2.1倍[6]。Poort等[7]研究发现，FII基因G20210A突变和FII 水平升高有显著相关性，该点发生突变可使静脉血栓形成危险性增加3倍。以上两种点突变发生时，均致使静脉内凝血机制发生异常，易形成BCS。西方国家有关这两种点突变致BCS有大量报道，由此认为，FV Leiden突变产生的APC 阻抑是BCS 发病的基本病因；而对于FIIG20210A突变致BCS发病的危险性有一定增加但并不非常显著，多个血栓形成高危因子并存时可使其发病率增高，这也说明BCS发病可能是不同的发病机制综合作用的结果。我国已有对散发性BCS进行以上两点检测的报道，均未发现存在点突变，但冯博等[8]发现6例家族性患者中有4例FV Leiden杂合型突变。结合国外的研究，在大多数的正常高加索人群中FV Leiden及FIIG20210A突变的频率分别为6%和2%左右[9]，而国内对此课题的研究并没有发现散发性BCS患者人群中存在两个位点的点突变[10]，在一定程度上表明FIIG20210A突变存在种族和地理分布的差异。此次研究我们采用了不同于国内其他课题组的基因检测方法，但结果相似，未在散发性的BCS人群中检测出此两点点突变，再次提示我国BCS的发病可能与这两个点突变没有关联。

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