猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的亚克隆及原核表达＊

李建辉，左玉柱，孙彦欣，范京惠

（河北农业大学动物科技学院，河北保定 071001）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是猪的一种高度接触性传染病，可引起母猪的生殖障碍以及仔猪严重的呼吸道疾病和高病死率［1］。本病的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），该病毒感染具有两个主要特征，一是持续性的感染，二是免疫抑制作用［2］。PRRSV主要结构蛋白有E蛋白、M蛋白和N蛋白，其中E蛋白即GP5蛋白，由病毒ORF5基因编码。GP5蛋白是PRRSV的囊膜糖蛋白，在病毒感染宿主细胞过程中起着重要作用，同时，还能刺激机体产生中和抗体［3］。但该蛋白含有的3个疏水跨膜区使得应用多种表达系统均难以获得GP5全基因的高效表达［4］。陈军义等［5］曾去除了 N末端的信号肽部分，扩增了GP5全基因中79bp～600 bp的基因片段，并成功地表达了GP5蛋白。Oleksiewicz M B等［6］从噬菌体12肽库中鉴定出一个高度保守的中和表位，即B表位。此外，在位于B表位的7个氨基酸之前，还有一高变异性的免疫优势区域称为A表位，该表位在感染后快速产生非中和抗体。这些特征使得A表位可能成为诱骗表位，从而减少针对邻近NE的保护性反应。顾小雪等［7］扩增了只包括A表位和B表位的一段小肽的基因片段，虽然成功表达，但并不能产生中和抗体。因此，为了获得含有中和活性的PRRSV－GP5蛋白，本研究根据PRRSV－GP5蛋白的结构特点，扩增去除信号肽及A表位的GP5基因获得dGP5，并对表达的PRRSV－dGP5融合蛋白进行SDS－PAGE和 Western blot分析，以期为深入研究PRRSV GP5蛋白的结构和功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

pGEX－6p－1载体和猪PRRS阳性血清均由河北农业大学动物科技学院微生物实验室保存；100bp DNA Lander、预染蛋白Marker购自北京全是金生物技术有限公司；限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、Simple－T 载 体、TaqDNA 聚 合 酶、DL 2 000 DNA plus Marker、T4DNA连接酶等购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒为康维世纪生物科技有限公司，HRP标记的羊抗猪IgG购自北京索莱宝科技有限公司；6份病料（肺脏）采自河北省保定地区临床上疑似PRRS的病猪，并经PCR诊断试剂盒检测为阳性。

1.2 方法

1.2.1 PRRSV GP5基因扩增、克隆及鉴定 根据GenBank中发表的PRRSV GP5全基因序列，使用Primer5.0 软 件 设 计 合 成 特 异 性 引 物。P1：5′－GGATCCAAGCTTATGTTGGGGAAA－3′；P2：5′－CCATGGCTCGAGCTAGAGACGAC－3′。 用 Trizol方法提取PRRSV总RNA，用随机引物进行反转录反应后，进行PCR扩增，目的片段的扩增条件为：95℃5min；94℃30s，52℃45s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、回收后与pMD18－T Vector连接，连接产物转化至感受态细胞DH5α。经质粒抽提、PCR鉴定正确后送天根公司测序，鉴定正确的重组质粒命名为pMD－GP5。

1.2.2 dGP5引物的设计与目的基因的PCR扩增

由于GP5蛋白在表达系统中难以表达，在设计引物P3、P4时将氨基端疏水性较强的信号肽序列去掉。根据Simple－T克隆载体以及pGEX－6p－1表达载体的特点，用Primer5.0软件设计特异性引物，并在上游引物引入BamHⅠ酶切位点，下游引物引入EcoRⅠ酶切位点，预期大小为513bp。引物由天根公司合成，分别为P3：GGATCCATGAGCAACAGCAACAG；P4：GAATTCCTAGAGACG －ACCCCATT。

以重组质粒pMD－GP5为模板，PCR扩增截短后的GP5基因，反应条件为：94℃5min；94℃40 s，51.7℃40s，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用琼脂糖凝胶回收DNA试剂盒进行纯化回收。

1.2.3 dGP5基因重组表达载体的构建 将纯化回收的dGP5基因扩增产物克隆至pMD18－T载体，命名为pMD18－T－dGP5。再用BamHⅠ和EcoRⅠ同时分别双酶切 pMD18－T－dGP5和表达载体pGEX－6p－1，经T4DNA连接酶连接后转化到E.coliDH5α感受态细胞，命名为pGEX－6p－dGP5。提取质粒后转入E.coliBL21（DE3）感受态细胞，进行PCR和双酶切鉴定以及序列测定。

1.2.4 重组表达载体的诱导表达 挑取含阳性重组表达质粒的单菌落，接种于含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中，37℃振荡培养至D600nm到0.7，加入终浓度为1mmol／L的IPTG。在30℃下诱导培养，分别于诱导前和诱导后2、3、4、6h取菌。将不同时间取的菌液12 000r／min离心1min，弃上清，再用PBS重悬菌液沉淀，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，煮沸变性5min，12 000r／min离心1min，取上清。

1.2.5 重组蛋白的SDS－PAGE鉴定 将分离胶与浓缩胶配好，加样时设置空载体和诱导前菌体作对照。电压在浓缩胶内为90V，在分离胶内为110V。电泳后，用考马斯亮蓝染色1h左右，再在脱色液中脱色2h，期间更换脱色液2次～3次，直到蛋白区域清晰为止。检查重组蛋白的表达情况。

1.2.6 重组蛋白的 Western blot分析 将重组蛋白进行SDS－PAGE电泳后，转印到NC膜。湿转3h后再转移至5 0g／L的脱脂奶粉封闭液中，4℃过夜。次日加入1∶100的猪PRRSV阳性血清（一抗）。室温下作用3h后，用TBST洗膜3次，每次6 min，然后加入1∶1 000稀释的HRP标记的羊抗猪IgG（二抗），室温振荡1h；洗涤同上。最后在暗处将洗涤后的NC膜放入新配置的DAB底物显色液中显色3min～5min，直至条带清晰后迅速用去离子水终止显色反应，拍照记录结果。

2 结果

2.1 PRRSV GP5基因的扩增

应用RT－PCR方法从疑似病猪的病料中扩增出了大小约为600bp的特异性条带，与预期大小相符（图1）。

2.2 原核表达质粒pGEX－6p－dGP5的构建与鉴定

以pMD－GP5为模板，P3和P4为引物，进行dGP5基因扩增，扩增产物经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切连接至pGEX－6P－1，重组质粒通过PCR扩增和酶切进行鉴定。由图2和图3可知，应用PCR方法从重组质粒中扩增出约500bp左右的特异性基因片段，对重组质粒进行双酶切，分别获得与空载体对照相一致的约4 360bp左右基因片段和约500bp左右的dGP5基因片段，将PCR和双酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序，并将阳性重组质粒命名为pGEX－6p－dGP5。

2.3 表达产物的SDS－PAGE分析

将含有阳性重组质粒的大肠埃希菌用IPTG诱导，在不同诱导时间取样，并经SDS－PAGE检测，结果在约40ku处可见表达条带，与预期蛋白大小相一致（图4），而未诱导菌和空载体菌诱导后，均没有出现此蛋白条带，且在诱导后4h表达量最高。

M.DNA标准DL 2 000；1.GP5基因的PCR产物M.DNA Marker DL 2 000；1.PCR products of GP5gene

图1 RT－PCR扩增的GP5基因Fig.1Amplification of GP5gene by RT－PCR

图2 重组质粒pGEX－6p－dGP5的PCR鉴定Fig.2Identification of pGEX－6p－dGP5gene by PCR

图3 重组质粒pGEX－6p－dGP5的酶切鉴定ig.3Identification of the plasmid pGEX－6p－dGP5by enzyme digestion

图4 诱导不同时间重组菌的SDS－PAGE分析Fig.4SDS－PAGE analysis of pGEX－6p－dGP5induced in different time

2.4 Western blot鉴定

DAB显色后，在约40ku处有特异性条带，而阴性空载体诱导对照无此特异性反应。证明重组的dGP5在大肠埃希菌中获得了正确表达，且表达蛋白具有良好的抗原性（图5）。

图5 PRRSV－dGP5蛋白的Western blot检测Fig.5Western blot detection of PRRSV－dGP5

3 讨论

猪繁殖与呼吸综合征在全世界范围内迅速的传播，给整个养猪业造成巨大的经济损失，因此研制出有效的疫苗就显得十分重要。本研究中成功得到了缺失了N端30个氨基酸残基的GP5蛋白，这为该疫苗的研制提供了选择的机会。有报道曾经证实，感染PRRSV康复猪的血清中GP5蛋白的抗体滴度与中和病毒的能力具有显著相关性［8］。可见，GP5蛋白可以在机体内产生中和抗体。但鲜有重组的GP5蛋白成功在体内产生中和抗体的报道，可能与A表位的存在，极大地延缓和减弱了B表位诱导中和抗体的产生有关［9］。本试验成功扩增出了缺失A表位基因的dGP5基因片段，为进一步研究中和抗体的产生奠定了基础。

PRRSV－GP5蛋白含有3个疏水跨膜区以及存在较多的大肠埃希菌稀有密码子，这些因素都严重影响了其表达量［10］。在本试验中，目的基因在表达载体pGEX－6P－1中的表达量并不高，证实了上述影响因素存在的可能性。另外，冷超粮等［11］研究结果表明，HP－PRRSV只有B表位并不能诱导产生中和抗体，推测在中和抗体产生的过程中，GP5基因中B表位之外的其他基因片段可能发挥了重要作用。因此本研究仅对N端信号肽序列以及A表位基因这一覆盖表位进行了敲除，而保留了包括B表位基因在内的大部分GP5基因，并在大肠埃希菌中成功表达了大小约40ku的GP5蛋白，经Western blot分析表明，重组的GP5蛋白能够和PRRSV阳性血清反应，具有良好的反应原性。然而，该融合蛋白能否较早激发较强的中和抗体值得进一步深入探究。

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