猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M基因重组腺病毒的构建及表达＊

高 博，马 玲，张 念，3，毛 燕，陈凤莲，张守峰，刘 烨，张 菲，扈荣良，吴健敏＊

（1.广西兽医研究所广西畜禽疫苗重点实验室，广西南宁 530001；2.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春 130122；3.吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春 130062）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的怀孕猪流产及仔猪呼吸道症状为主要特征，并造成世界养猪业巨大经济损失的一种免疫抑制性疾病［1－2］。PRRSV属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属成员［3］。基因组为单股正链RNA病毒，包含8个～9个开放阅读框，其中ORF1a和ORF1b编码病毒的非结构蛋白，ORF2～ORF7编码结构蛋白，GP2～GP5为糖基化蛋白，N蛋白为核蛋白，M 蛋白为基质蛋白［4－6］。由ORF5编码的GP5蛋白可以诱导机体产生中和抗体，是最主要的保护性抗原；由ORF6编码的M蛋白是PRRSV结构蛋白中最保守的蛋白，具有很强的免疫原性，与细胞免疫有关［7］，且研究表明 M蛋白可以对GP5蛋白产生协同作用，使其产生的抗体水平更高。基于此，本研究将GP5和M基因作为构建重组活载体疫苗的候选基因。

1953年，Rowe W P等［8］在用扁桃体组织块培养物分离“感冒病毒”过程中发现了一种未知病毒。第2年，Hilleman M R等［9］从急性呼吸道患者分离出类似的病毒。1956年，Enders J F等［10］根据病毒经常存在于腺体，且第1次就是从腺体组织中分离获得的事实，建议将这类病毒称为“腺病毒”。此后，相继由人、猴、猪、马、牛、羊、犬、小鼠和鸡等分离出100多个血清型的腺病毒［11］。腺病毒可感染分裂细胞和非分裂细胞，转导细胞种类多，如肺细胞、肝细胞、骨细胞、肌肉细胞、脑细胞等。其感染细胞滴度和外源基因的表达水平较高，因此腺病毒同疱疹病毒、逆转录病毒、痘病毒一样是目前最为广泛使用的病毒载体。以腺病毒为载体构建重组疫苗，表达主要抗原及以腺病毒为载体进行癌症、遗传病和重要传染病的基因治疗等，是当前科研工作者研究的重点和热点。本研究是以腺病毒为载体，以GP5和M基因为靶基因构建PRRS重组腺病毒，以期为PRRS重组腺病毒疫苗的研制提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、质粒、细胞、菌种 PRRSV、pIRESneo质粒、DH5α菌种均由本实验室保存；pMD18－T购自TaKaRa公司；293AD细胞（人胚肾细胞）、pac－Ad5CMVK－NpA 穿梭载体、pacAd5 9.2－100骨架载体购于CELL BIOLABS公司。

1.1.2 试剂 AMV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、dNTP、Ex－TaqDNA 聚 合 酶、CAIP、T4DNA连接酶以及限制性内切酶EcoR V、EcoR I、SmaI、XhoI、MluI、BST1107I购自宝生物工程（大连）有限公司；Klenow购自Biolabs公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自Axygen公司；转染试剂FuGENE®HD Transfection Reagent购自Roche公司；荧光素FITC标记羊抗鼠IgG、辣根标记羊抗鼠IgG购自GeneTex公司；伊文思蓝购自Sigma公司产品；甲醇、吐温－80购自北京北化精细化学品有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 参考GenBank登录号AF032626关于Ch－1a株的全基因序列，利用primer5.0设计并合成针对PRRSV基因GP5和M基因全长的特异引物（划线部分为引入的EcoR V、BamH I和EcoR V、SpeI），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成（表1）。

表1 PCR引物序列Table 1Primer sequences of PCR

1.2.2 载体的构建 以PRRSV细胞毒为模板，PCR扩增出GP5和M基因，将GP5定向克隆至真核表达载体pIRES－neor的多克隆位点EcoR V和EcoR I之间的同时用M基因替代压力筛选基因neor，构建重组真核表达载体pIRES－GP5－M；将包含有GP5和 M基因的表达盒定向克隆至穿梭质粒pacAd5CMVKNpA多克隆位点EcoR V处，获得重组穿梭质粒pac－Ad5CMVK－NpA－GP5－M。

1.2.3 重组腺病毒的获得 线性化的重组穿梭质粒pacAd5CMVK－NpA－GP5－M与pacI消化的骨架质粒pacAd5 9.2－100于六孔板中共转染293AD细胞。7d观察细胞病变（Cytopathic effect，CPE），若无CPE，补加1mL100mL／L小牛血清的DMEM。之后，每天观察1次，待14d，若还没有CPE，继续补加1mL的100mL／L小牛血清 的DMEM 培养至21d，若无CPE，则将其反复冻融2次，10%接种293AD细胞，培养3d～4d，若没有CPE，则判断转染失败。若中间过程出现CPE，待其病变程度达到80%，反复冻融2次，接293AD细胞，连续3代若均出现CPE，则认为获得重组病毒。

1.2.4 重组病毒的鉴定

1.2.4.1 重组病毒的PCR扩增 取50μL病变的293AD细胞，煮沸5min之后，12 000g／min离心5min，取上清作为模板，进行PCR扩增。

1.2.4.2 间 接 免 疫 荧 光 （indirect immunofluorescence） 在96孔板中铺加正常的293AD细胞，待其长 成 80%，每 孔 加 入 重 组 腺 病 毒 rAdv－GP5－M 100μL，在37℃、体积分数为5%CO2温箱培养24h，使重组腺病毒充分感染293AD细胞。用丙酮与甲醛1∶1固定10min后；以PRRSV高免血清为一抗，孵育2h，PBS洗涤3次；以荧光标记的羊抗鼠的IgG为二抗，37℃作用30min，PBS洗涤3次，吹干，加入缓冲甘油，荧光显微镜下观察。

1.2.5 Western blot分析 将接种重组腺病毒rAdv－GP5－M的293AD细胞培养24h，用细胞裂解液裂解后，离心取上清进行SDS－PAGE。之后转印到硝酸纤维素膜上，用脱脂牛奶封闭后，加入高免血清，37℃孵育1h，PBS洗涤3次之后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，37℃作用40min，洗涤后加入显色液显色，观察。

1.2.6 重组病毒的纯化及电镜观察 将收获的病毒液上清，在4℃ 以12 000r／min离心10min，去除细胞碎片。将上清加到Beckman离心管中，每管加入10mL，25 000r／min离心2h，将收获的病毒液冻于－70℃保存。取纯化的病毒10μL，电镜观察病毒形态。

1.2.7 重组病毒的TCID50测定 在6孔板中，每孔铺上2mL的293AD细胞混合液，约含有2×105细胞／mL，使细胞均匀分散，放入37℃、体积分数为5%CO2温箱培养24h。将病毒200μL接种于293AD细胞中，继续在温箱培养3d～5d，每天观察细胞病变。参照文献［8］中的Karber法计算TCID50。

1.2.8 重组病毒的遗传稳定性 重组病毒连续多次传代，测定其遗传稳定性。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

以PRRSV细胞毒为模板，PCR扩增出GP5和M片段，获得大小603bp和525bp的片段，结果如图1和图2。

图1 GP5基因的PCR扩增Fig.1PCR identification of GP5gene

图2 M基因的PCR扩增Fig.2PCR identification of M gene

2.2 重组真核表达载体pIRES－GP5－M的酶切鉴定

将测序正确之后的GP5和M基因定向克隆至pIRESneo质粒之后，以MluI和Bst1107I双酶切pIRES－GP5－M，获得大小3 062bp和2 566bp的片段（图3）。

图3 pIRES－GP5－M 的酶切鉴定Fig.3Identification of the pIRES－GP5－M by enzyme digestion

2.3 重组穿梭载体 pacAd5CMVK－NpA－GP5－M的鉴定

将含有GP5和M基因的表达盒，定向克隆至穿梭载体pacAd5CMVK－NpA，构建重组穿梭质粒pacAd5CMVK－NpA－GP5－M，以PacI对 pacAd5 CMVK－NpA－GP5－M 进行了鉴定，用250bp DNA Marker和用DNA Marker DL 15 000分别进行电泳，结果如图4。

图4 pacAd5CMVK－NpA－GP5－M的鉴定Fig.4Identification of pacAd5CMVK－NpA－GP5－M

2.4 重组病毒的获得

转染后14d细胞局部出现变圆、聚集、随后会大量脱落，如图5。

图5 重组病毒的拯救Fig.5Rescue of the recombinant virus

2.5 重组病毒的PCR扩增

将病变细胞冻融物煮沸5min作为模板，扩增GP5和M基因，获得大小603bp和525bp的片段，结果如图6。

1，2.PCR产物（GP5）；M.DNA标准 DL 2 000；3.阴性对照；4.PCR产物1，2.PCR products（GP5）；M.DNA Marker DL 2 000；3.Negative control；4.PCR products

2.6 间接免疫荧光检测结果

以PRRSV阳性血清为一抗，以荧光标记的羊抗鼠的IgG为二抗，进行间接免疫荧光组化，结果显示重组病毒感染的细胞出现荧光，而对照组没有荧光，如图7。

2.7 Western blot分析

将重组腺病毒接种于293AD细胞，连续培养24h，用细胞裂解液裂解细胞，以PRRS高免血清为一抗，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行Western blot分析。获得大小18ku和25ku的目的条带，结果如图8。

2.8 TCID50的测定

接种后96h，观察细胞病变，并计算TCID50，该重组病毒的 TCID50为10－6.5／mL。

2.9 遗传稳定性试验结果

连续传代试验证实，重组腺病毒在细胞内繁殖，可以有效地转录并表达GP5和M蛋白，具有较高的遗传稳定性。

图7 间接免疫荧光分析Fig.7Indirect immunofluorescence test

图8 重组病毒rAd5v－GP5－M Western blot分析Fig.8Western blot analysis of rAd5v－GP5－M

3 讨论

PRRSV是引起PRRS的病原，基因组包含6个～7个结构蛋白，其中GP5蛋白可以诱导机体产生中和抗体，是其最主要的抗原蛋白。M蛋白的免疫原性非常好，感染后10d就可以检测到免疫应答，且该蛋白可以提高细胞免疫，协同作用而使GP5产生的抗体水平提高［12］。因而本研究以GP5和M基因为靶基因，构建了一株重组腺病毒，并对该腺病毒进行了一系列的鉴定和分析，为新型PRRSV活载体疫苗的研制提供了基础。

PRRS被发现以来，每年对世界养猪业造成的经济损失难以估量。而目前对该病的防制主要是疫苗接种（传统疫苗）。但传统疫苗如灭活苗存在免疫失、免疫次数多、免疫剂量大及抗体产生期比较长等缺点；虽然弱毒苗抗体产生速度快，但使用弱毒苗而导致猪发病的例子屡见不鲜。且血清学不能区分疫苗免疫和野毒感染，为国际贸易带来了不便，因而新型疫苗的研制就成为热点。其中活载体疫苗因其免疫动物向宿主免疫系统提交免疫原性蛋白的方式与自然感染时的真实情况很接近，可诱导产生体液免疫和细胞免疫，甚至黏膜免疫等优点，为众多研究者所青睐。而腺病毒是其中背景最为清楚，研究最为透彻的活病毒载体之一，在众多腺病毒载体中，又以Ad2和Ad5研究最多，也应用最为广泛。本研究所使用的腺病毒表达系统是由CELL BIOLABS公司研发的人5型腺病毒表达系统，该系统在以前腺病毒的基础上进行了进一步的优化，缺失了E1区和左侧的ITR，由辅助细胞系和骨架质粒提供，使之成为复制缺陷型病毒，进一步降低了复制性病毒的出现；细胞内同源重组避免了经典同源重组方法中的蚀斑筛选及pAdEasy Expression System细菌内同源重组子筛选所耗费的大量人力和物力，可以在短短21d内获得重组病毒，重组病毒具有很好的遗传稳定性，且外源基因的表达量更高。

本研究将PRRSV GP5和M基因为靶基因，构建了1株含有GP5和M基因的重组腺病毒，并在293AD细胞上得到了表达，滴度测定和连续传代试验结果表明该重组腺病毒的滴度可以达到10－6.5TCID50，且具有良好的遗传稳定性，为PRRSV重组腺病毒疫苗的研制打下了基础。

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