伪狂犬病病毒TJ1株生物学特性研究＊－

韩 伟，张 莉＊，鄢明华，李秀丽，高俊成，韩孝党

（1.天津市畜牧兽医研究所，天津 300112；2.天津市西青区畜牧水产业发展服务中心，天津 300380）

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一种急性传染病。该病毒属于疱疹病毒科甲疱疹病毒亚科［1－2］，猪是其自然宿主和储存宿主，可以引起包括猪在内的多种家畜和野生动物发病。新生仔猪临床表现为呼吸困难、厌食、腹泻和神经症状，发病率和死亡率可达100%；妊娠母猪可引发流产、产死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍症，耐过猪感染后形成潜伏感染而终身带毒［3－4］。随着PRV基因缺失疫苗的应用，该病已经得到有效控制，但在一些小规模猪场仍时有发生。笔者从天津某猪场分离到一株伪狂犬病病毒（TJ－1株），对其主要生物学特性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及细胞系 PRV TJ－1株、PK－15、BHK－21和Marc－145细胞均为天津市畜牧兽医研究所兽医研究室保存。

1.1.2 主要试剂 MEM培养基购自GIBCO公司，新生牛血清购自北京民海生物有限公司，PRV荧光标记抗体购自中国兽药监察所。

1.1.3 种蛋及试验用动物 种蛋购自天津市某种鸡场，在本室孵化至10日龄后使用；试验用兔购自天津西青区某养殖场。

1.2 方法

1.2.1 病毒理化特性测定

1.2.1.1 病毒增殖及预处理 PK－15细胞接种 PRV TJ－1株，待出现90%～95%CPE时收获毒液，3 000r／min离心20min，取上清用于后续试验。

1.2.1.2 乙醚敏感性试验 按照文献［5］进行。取灭菌离心管6只，各加入0.8mL收获的TJ－1株病毒液，其中3管加入0.2mL乙醚，另3管加入0.2mL生理盐水作为对照。密闭管口，充分震荡，置4℃处理24h后2 000r／min离心20min。吸取含乙醚的离心管的下层病毒液，在超净台内反复吹吸使乙醚完全挥发后备用。将6个离心管的病毒液分别接种PK－15细胞，测定其TCID50，病毒滴度降低2个数量级判为敏感，反之判为不敏感。

1.2.1.3 氯仿敏感性试验 按照文献［5］进行。取灭菌离心管6只，各加入1mL收获的TJ－1株病毒液，其中3管加入48μL氯仿，另3管加入48μL生理盐水作为对照。充分混匀震荡，置4℃处理10min，500r／min离心5min。吸取试验组离心管上层的病毒液备用。将6个离心管的病毒液分别接种PK－15细胞，测定其TCID50，病毒滴度降低2个数量级判为敏感。

1.2.1.4 胰蛋白酶敏感性试验 按照文献［5］进行。取灭菌离心管6只，各加入0.5mL收获的TJ－1株病毒液，其中3管加入0.5mL胰酶（浓度1%），另3管加入0.5mL生理盐水作为对照。密闭管口，充分震荡离心管，37℃水浴作用1h，加入灭活犊牛血清4mL，充分混合后备用。将6个离心管的病毒液分别接种PK－15细胞，测定其TCID50，病毒滴度降低2个数量级判为敏感，反之判为不敏感。

1.2.1.5 酸碱敏感性试验 按照文献［5］进行。取装有TJ－1株培养物2mL的离心管6只，用0.1 mol／L HCl和 NaOH 调 pH 至3、5、6、8、10、11，于37℃水浴作用1h，在接种细胞前将所有离心管中液体 pH 调至7.0，立即接种 PK－15 细胞，测定TCID50。试验重复3次，观察pH对病毒效价的影响。

1.2.1.6 热敏感性试验 按照文献［6－7］进行。取盛有TJ－1株培养物1mL的离心管6只，置于56℃水浴，分别于作用5、10、15、30、45、60min后，取出接种于PK－15细胞，测定其TCID50，病毒滴度降低2个数量级判为敏感，该试验重复3次。

1.2.2 免疫荧光试验 将灭菌飞片置于24孔板内，每孔加入一定量的PK－15细胞，待长成单层后，在每个飞片上接种TJ－1株，同时设不接毒细胞对照。取接毒24h～48h的飞片，用PBS缓冲液漂洗2次，置丙酮中固定20min后自然风干，加入PRV荧光标记抗体，37℃作用2h，再用PBS液冲洗，吸去飞片表面的水分，滴加500mL／L甘油碳酸盐缓冲液，加盖玻片，荧光显微镜观察结果。

1.2.3 细胞培养特性 将TJ－1株分别接种于PK－15、BHK－21和 Marc－145细胞，于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，记录病毒在3种细胞上的产生病变的情况。

1.2.4 鸡胚绒毛尿囊膜接种 按照文献［8］进行。将TJ－1株接种于3枚10日龄鸡胚绒毛尿囊膜，每枚接种0.2mL，同时用相同剂量的MEM维持液接种鸡胚作为对照。鸡胚置培养箱继续孵化144h，每日照蛋2次，弃去24h死亡鸡胚，观察24h～144h死亡和未死亡的鸡胚绒毛尿囊膜是否有痘斑形成。1.2.5 家兔人工感染试验 按照文献［9］进行。取TJ－1株的细胞培养物颈部皮下接种于3只家兔，每只注射1mL，空白对照家兔接种相同剂量的MEM维持液，两个试验组分开隔离饲养14d，每天观察家兔的采食、体温、精神状态等情况。

2 结果

2.1 病毒理化特性的测定

由表1可见，PRV TJ－1株经乙醚、氯仿、胰蛋白酶处理后病毒滴度显著下降，说明病毒对这3种试剂均敏感；由图1可见，该病毒在pH 5.0以下和8.0以上，TCID50明显降低，在pH 5.0至8.0之间病毒较稳定，TCID50变化幅度小；由图2可见，病毒在56℃条件下，随着时间的延长，病毒滴度逐渐降低，至60min时病毒可被灭活。

表1 伪狂犬病病毒TJ－1株对乙醚、氯仿、胰蛋白酶敏感性Table 1The sensitivity of PRV TJ－1strain to ethyl ether，chloroform and trypsin（TCID50／0.1mL）.

图1 伪狂犬病病毒TJ－1株对酸碱敏感性Fig.1The sensitivity of PRV TJ－1strain to acid and alkali

图2 伪狂犬病病毒TJ－1株对56℃热灭活敏感性Fig.2The sensitivity of PRV TJ－1strain to heat－inactivation at 56 ℃

2.2 免疫荧光试验

用PRV荧光标记抗体检测感染TJ－1株的PK－15细胞，在胞浆内可见特异性的绿色荧光，而正常的PK－15细胞无荧光（图3）。

2.3 病毒在3种细胞上的增殖特性

PRV TJ－1 株 在 PK－15、BHK－21 和 Marc－145细胞上均能生长，但细胞病变存在明显差异（图4）。PK－15细胞接毒后早期可见细胞膨大，随之细胞变性圆缩，继而开始脱落逐渐形成空斑病灶；BHK－21细胞接毒后感染细胞变性圆缩，有合胞体出现，细胞逐渐死亡脱落，形成分散病灶区；Marc－145细胞接毒后，早期可见细胞拉长，随之细胞变圆，细胞逐渐融合形成空斑，继而逐渐脱落。试验中PK－15和BHK－21两种细胞在18h～24h即可出现细胞病变，Marc－145在24h～28h出现细胞病变。

图3 伪狂犬病病毒TJ－1株感染PK－15细胞免疫荧光实验结果（200×）Fig.3Immunofluorescence test result of PK－15cell inoculated with PRV TJ－1（200×）

图4 伪狂犬病病毒TJ－1株在3种细胞上的细胞病变Fig.4CPE of PRV TJ－1strain on three cell lines

2.4 鸡胚绒毛尿囊膜接种

接种TJ－1毒株后144h，鸡胚均未死亡，4℃冻胚4h后观察病变，可见鸡胚绒毛尿囊膜水肿、增厚并有白色的痘斑，对照鸡胚绒毛尿囊膜无异常病变（图5）。

图5 鸡胚尿囊膜形成痘斑Fig.5 Pox spots on chick chorioallantoic membrane

2.5 动物试验

接种TJ－1毒株细胞培养物3d后的兔子表现为奇痒，用嘴啃咬注射部位，使注射部位被毛脱落，皮肤受损，继而死亡。而注射MEM维持液对照家兔无异常变化。

3 讨论

伪狂犬病是多种家畜和野生动物的一种重要的病毒性传染病，给养殖业带来很大的经济损失。德国、瑞典、奥地利、英国和丹麦等已经实现了PR的净化，在我国近些年随着伪狂犬病病毒基因缺失疫苗和gE－ELISA抗体检测方法的使用［10］，已鲜有大规模发病的报道。在天津地区某猪场笔者分离到了伪狂犬病病毒，说明仍需重视该病的防控，特别是大型养殖场应定期对猪群进行监测，制定净化方案而消灭本病。本文对伪狂犬病病毒天津（TJ－1）分离株的主要生物学特性进行分析，结果将为该毒株的深入研究奠定基础。

本研究对伪狂犬病病毒TJ－1株的理化特性分析表明，该毒株对乙醚、氯仿、胰蛋白酶均敏感，在pH 5至8之间病毒较稳定，而当pH为3或者11时，病毒在37℃1h可以被灭活。此外，该毒株对热有一定的抵抗力，病毒在56℃条件下，随着时间的增长，病毒滴度逐渐降低。本文试验数据与陈陆等报道的伪狂犬病病毒Fa株的理化特性相似，但TJ－1株在耐热性方面较弱，置于56℃ 经60min病毒可被灭活。

伪狂犬病病毒为疱疹病毒属病毒，具有广嗜性，研究报道该病毒能在多种细胞上增殖［11－13］。为了解TJ－1株的细胞增殖特性，本文将其接种于PK－15、BHK－21和Marc－145细胞，结果发现该毒株在3种细胞上均可增殖。3种细胞相同的细胞病变主要为细胞变圆，形成散在病灶，继而逐渐扩散至全部细胞，细胞溶解脱落。但是3种细胞产生病变的时间不同，而且只在BHK－21细胞观察到了多核合胞体。

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