1型鸭疫里氏杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立＊

杨依霏，罗青平，张蓉蓉，艾地云，廖永洪，邵华斌＊，程国富＊

（1.华中农业大学动物医学院动物病理实验室，湖北武汉430070；2.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，湖北武汉430064）

鸭疫里氏杆菌（Riemerellaanatipestifer，RA）是一种隶属于黄杆菌科，无运动性、不形成芽胞的革兰阴性菌。该菌可引起鸭、火鸡以及其他水禽的疾病，即鸭疫里氏杆菌病或传染性浆膜炎［1］，可以引起雏鸭的大量死亡，给养鸭业带来了巨大的经济损失。RA的血清型复杂，目前公认的有21种［2］，给本病的免疫预防和诊断带来极大困难。虽然国内外已经先后报道了检测RA血清抗体的玻板凝集试验、琼脂扩散试验以及间接免疫荧光抗体检测等方法。但也存在灵敏度低、操作步骤繁琐、检测设备昂贵等缺点。ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，是目前应用广泛的检测方法之一。外膜蛋白（omp）是革兰阴性菌特有的一种结构蛋白，具有良好的免疫原性，是亚单位疫苗的候选组成部分，成为目前的研究热点。本研究中选取RA的外膜蛋白ompA基因进行克隆和原核表达，建立以重组ompA蛋白为包被抗原，检测RA血清抗体的间接ELISA方法。

1 材料与方法

1.1 材料

原核表达载体pET－28a（＋），感受态细胞E.coliBL21－DE3，1型鸭疫里氏杆菌菌株由湖北省农科院畜牧兽医所保存。TransTaq－T、dNTPs、DNA标准DL 2 000、DNA标准DL15 000购自北京全式金公司；限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ，T4连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司；低分子质量标准蛋白Marker购自于Fermentas公司；凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自于北京索莱宝科技有限公司；细菌基因组提取试剂盒购自于北京天根生物科技公司；镍亲和层析柱填料购自于GE Healthcare；HRP标记的兔抗鸭IgY购自于美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 ompA蛋白的表达纯化及活性检测

1.2.1.1 引物设计 根据GenBank公布（登录号：FJ765052）GD081108株ompA 全 序 列，应 用primer 5软件设计特异性引物，分别在上游与下游插入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物F：5′－CCATGGATCCATGGACAAGGAGTTTATG－3′，下 游 引 物 R： 5′ －CGCCTCGAGTTATTTTCTTTTCTTTTTTAC－3′

1.2.1.2 DNA的提取 挑取RA单菌落于TSB（含100mL／L新生牛血清）培养基中，摇振过夜培养。取新鲜菌液用细菌基因组提取试剂盒提取DNA。

1.2.1.3 PCR扩增及鉴定 在PCR反应管中加入10μL 10×PCR buffer，上下游引物各 4μL，2.5mmol／L dNTPs 4 μL，TransTaq－T 2μL，DNA模板4μL，加灭菌ddH2O补足至100μL。PCR反应条件：95℃7min；95℃50s；55℃50s；72℃90s，30个循环；72℃7min。经10g／L琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，凝胶回收试剂盒回收。

1.2.1.4 原核表达载体的构建和表达 将ompA基因片段经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到原核表达载体pET－28a（＋），转化感受态细胞E.coliBL21－DE3，挑取单菌落扩大培养后提取质粒DNA。经双酶切鉴定，选出重组质粒转化阳性菌，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序正确的阳性克隆接种于LB液体培养基（含50μg／mL卡那霉素）中，以终浓度为1mmol／L的IPTG诱导表达5h，收集菌体。超声波破碎菌体，分别取破碎后沉淀和上清，经120g／L SDS－PAGE电泳检测表达蛋白。

1.2.1.5 表达蛋白的纯化 按照《分子克隆实验指南》［3］中的蛋白质纯化一节操作。诱导表达的蛋白用8mol／L尿素裂解过夜，离心取上清。经 His－Bind树脂进行纯化，取2mL镍亲和层析填料装入层析柱中，先后分别用200mL／L乙醇、ddH2O各20mL清洗填料；加入平衡缓冲液20mL平衡柱子；上样，速度在0.5mL／min以内；加入平衡缓冲液20mL洗掉杂蛋白；用含有250mmol／L咪唑的洗脱缓冲液20mL洗下蛋白；ddH2O 清洗填料；取200mL／L乙醇保护填料。

1.2.1.6 免疫转印表达产物 经SDS－PAGE电泳后以恒温电流80mA，45min电转移至硝酸纤维膜（NC膜）上，将薄膜放入含有30g／L BSA的PBST（0.01mol／L，pH 7.4）中室温水平摇床封闭1h～2h，0.01mol／L PBST洗涤3次，于1∶200稀释的1型 RA阳性血清中（0.01mol／L PBST稀释）4℃作用过夜，洗涤3次，再加1∶5 000稀释的HRP标记的兔抗鸭IgY，37℃作用1h，洗涤3次，加DAB＋H2O2显色，显色结束后用ddH2O终止反应。

1.2.2 间接ELISA检测方法的建立

1.2.2.1 RA阴性和阳性血清的制备 按常规方法制备阳性血清和阴性血清。选7d健康麻鸭10羽，用1型鸭疫里氏杆菌灭活油乳剂疫苗颈部皮下注射，3次免疫，每次免疫间隔14d。收集血清备用。同时收集未免疫的雏鸭血清作为阴性血清备用。

1.2.2.2 间接ELISA方法的操作 ①将纯化的ompA重组蛋白用包被液稀释后每孔加100μL，4℃包被过夜，用洗涤液洗涤3次，每次3min；②以含10g／L BSA的PBST于37℃封闭1h，同上洗涤；③每孔加入待检血清100μL，37℃孵育1h，同上洗涤；④每孔加入建议工作浓度的HRP标记的兔抗鸭IgY 100μL，37℃孵育1h，同上洗涤；⑤每孔加入100μL的反应底物液，37℃避光反应10min；⑥加入100μL终止液，然后在酶标仪上读取OD450nm值。每板设立阴阳性对照孔。

1.2.2.3 阴阳性临界值确定 取30份阴性血清100倍稀释后作为待检血清，测OD450nm值后求平均值和标准差，以¯x＋3SD为此间接ELISA方法的阴性临界值。

1.2.2.4 ELISA 的特异性试验

1.2.2.4.1 交叉试验 在相同条件下，按1.2.2.2操作步骤。以鸭源大肠埃希菌、鸭源多杀巴氏杆菌、鸭源链球菌、鸭源呼肠病毒、1型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒的阳性血清为被检血清，测OD450nm值。

1.2.2.4.2 阻断试验 阳性血清与阴性血清中按1∶10（v／v）的比例加入RA抗原，混匀后37℃作用1h，10 000r／min离心20min。用此处理过的阴、阳性血清1∶100稀释后，与未加抗原处理的阴、阳性血清同时作间接ELISA测定。比较阻断前后血清的OD450nm值变化。

1.2.2.5 ELISA的重复性试验 取同一批包被的重组蛋白ompA酶标条，在其他条件不变的情况下对4份鸭血清用已建立的间接ELISA方法进行检测，每份样品重复检测4孔，测得OD450nm值，计算其变异系数（CV）。用同样4份血清在3块不同批包被的酶标条上试验，测得OD450nm值，计算其变异系数（CV）。

1.2.2.6 间接ELISA检测方法与微量凝集试验敏感性比较 取RA阳性血清4份分别进行间接ELISA检测与微量凝集试验，测定血清效价。

1.2.2.7 标准曲线与回归方程的建立 应用直线回归分析，1∶100稀释的鸭血清OD450nm值与ELISA效价具一定的有线性关系。操作方法如下：取20份不同滴度的RA阳性血清，1∶100稀释后，再倍比稀释7个滴度作间接ELISA。每份血清的ELISA效价定为OD450nm值大于阴阳性血清临界值的血清最高稀释浓度。最后以每份血清最佳稀释倍数稀释时的OD450nm值为横坐标，以相应血清ELISA效价（ET）倒数的自然对数为纵坐标作回归曲线。

1.2.3 RA灭活油乳剂疫苗免疫雏鸭后抗体消长规律 于湖北省某鸭场购1日龄麻鸭40羽，随机分成2组（20羽／组）。试验组于7d、14d免疫1型RA灭活油乳剂疫苗，颈部皮下注射0.5mL／羽；对照组同时皮下注射等量生理盐水。分别在免疫后定期采血测定对照组、免疫组ELISA效价，做出抗体消长曲线。

2 结果

2.1 pET－28a（＋）－ompA 质粒的构建及重组ompA蛋白的表达与纯化

2.1.1 ompA基因的PCR扩增及测序 经PCR扩增后，电泳检测，结果与预期大小相符，为1 200bp左右的目的条带（图1）。测序结果显示，目的片段长度为1 164bp。将目的基因序列在Gen－Bank经Blast分析，与不同地区鸭疫里氏杆菌ompA的序列进行比对（登录号：FJ65052、FJ65042、HO701135、EF117758等），其同源性为96%～100%。

2.1.2 pET－28a（＋）－opmA 基因的克隆及鉴定将ompA基因片段定向插入到原核表达载体pET－28a（＋）中，随机挑取单菌落提取质粒，并用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切验证，电泳可见约5.3kb和1 164bp条带（图2）。

2.1.3 ompA重组蛋白的表达及纯化 将pET－28a（＋）－ompA 重组质粒转化到E.coliBL21－DE3中挑取阳性菌，扩大培养后加入终浓度1mmol／L的IPTG诱导5h后，菌液经低温超声破碎后，表达产物主要存在于裂解菌液的包涵体中，呈不溶性表达。经120g／L SDS－PAGE电泳检测，目的蛋白约为42ku（图3）。经尿素变性后，His－Band亲和纯化后进行Western blot分析，与RA阳性血清呈阳性反应（图4）。

图3 重组蛋白ompA的SDS－PAGEFig.3 SDS－PAGE of recombinant protein of ompA

图2 重组质粒pET－28a（＋）－ompA双酶切鉴定Fig.2Double enzyme digestion identification of the recombinantion plasmid with BamHⅠand XhoⅠ

图4 重组蛋白ompA的Western blot分析Fig.4Western blot analysis of recombinant ompA

2.2 间接ELISA方法的建立

2.2.1 间接ELISA最佳反应条件的确定 方阵滴定法结果显示，重组ompA蛋白的间接ELISA的最佳抗原包被浓度为1.5μg／mL，最佳血清稀释度为1∶100。酶标兔抗鸭IgY的最佳工作浓度为1∶5 000。

2.2.2 间接ELISA阴阳性临界值的确定 30份阴性血清1∶100稀释后，经间接ELISA检测的平均值OD450nm为0.099，标准差为0.022，则¯x＋3SD 为0.166，即为阴性血清的临界值。

2.2.3 特异性试验 鸭源其他病原体抗血清1∶100稀释后与ompA重组蛋白反应，均呈阴性反应，RA阳性血清呈阳性反应（表1）。3份阳性血清阻断后的OD450nm值明显低于阻断前的检测值，表明重组ompA蛋白抗原特异性吸附被检血清的特异性抗体（表2）。

2.2.4 重复性试验 以不同效价的血清稀释100倍后做平行重复ELISA检测，结果显示批内重复的变异系数小于5%（1.8%～4.6%），批间重复变异系数小于9%（1.2%～8.8%）。

2.2.5 间接ELISA与微量凝集试验的敏感性 比较结果表明，建立的间接ELISA检测方法的敏感性要明显高于普通的微量凝集试验。对选取的4份RA阳性血清效价进行测定结果显示，微量凝集试验接ELISA结果显示血清效价分别为1∶1 600、1∶1 600、1∶800、1∶12 800，即间接ELISA检测的灵敏度约为微量凝集试验的16倍～128倍（表3）。

2.2.6 标准曲线与回归方程的建立 阳性血清ELISA效价倒数的对数与血清1∶100稀释时的OD450nm之间存在相关性，根据实验数据建立了回归方程为ln（ET倒数）＝3.239 1OD450nm＋3.003 6，R2＝0.986 2，相关性良好。

2.2.7 RA灭活油乳剂疫苗免疫雏鸭后抗体水平对免疫过RA灭活油乳剂疫苗的雏鸭进行抗体水平动态监测数据显示，在免疫接种后7d鸭血清中的抗体含量开始有上升趋势，在35d抗体水平检测4份血清效价分别为1∶50、1∶50、1∶50、1∶100， 间达到高峰，之后开始下降，在免疫接种后77d左右抗体水平与免疫接种后14d的抗体水平相近（图5）。

表1 ompA重组蛋白与鸭的其他病原抗血清的交叉试验Table 1Cross reactivity of the recombinant ompA protein with the antisera against other pathogens in ducks

表2 重组ompA抗原的阻断试验结果Table 2Blocking analysis of the recombinant ompA protein with positive antisera

表3 间接ELISA和微量凝集试验检测RA抗体敏感性比较Table 3Comparison of sensitivity between indirect ELISA and antibody micro－agglutination test

图5 免疫血清1型RA灭活油乳剂疫苗免疫接种后抗体水平的变化Fig 5Antibody titer after immunization of inactivated oil emulsion vaccine of Riemerella anatipestifer serotype 1

3 讨论

在用间接ELISA检测RA抗体效价的相关报道方面，胡清海［4］利用 LPS，辜新贵等［5］利用重组蛋白P25，程龙飞［6］、程安春［7］李富祥［8］等分别用全菌蛋白以及Huang B等［9］用重组蛋白P45N作为包被抗原均取得了较理想的效果。此外，Hu Q等［10］建立了m－PCR方法用来检测RA抗原，Christensen H等［11］建立了区分RA血清型的PCR检测方法。本研究选取了RA的ompA作为ELISA方法中的包被抗原，这是全基因组序列中相对保守的一段序列，变异较少，Hu Q［12］、Liu Y 等［13］已 经证实ompA 是 RA 的一种毒力因子。并且ompA具有良好的免疫原性并且能诱导保护性免疫反应［14］。因此，ompA不仅具有血清学检测价值，还可以作为亚单位疫苗的候选成分之一。试验采用原核表达技术成功构建了重组质粒pET－28a（＋）－ompA，经IPTG诱导成功表达ompA蛋白，原核表达的蛋白能与抗血清发生反应。经过亲和层析纯化，将纯化后的蛋白作为包被抗原，避免了一些杂蛋白导致的非特异性结合，减少假阳性产生的几率。

关于检测鸭血清中抗RA抗体含量的报道中，主要的检测方法有凝集试验、琼脂扩散试验以及间接荧光抗体检测等方法。凝集试验和琼脂扩散试验主要用于血清分型，且以上两种方法灵敏度较ELISA方法低，程安春［7］等均有相关报道证明凝集试验的敏感性远远低于间接ELISA方法。本研究建立的ELISA方法的敏感性是微量凝集试验的敏感性的16倍～128倍，进一步验证了该结论。

ompA为鸭疫里氏杆菌全基因组序列中相对保守的一段序列，变异较少，因此在理论上克隆表达的ompA蛋白应该可以检测出多种血清型鸭疫里氏杆菌抗体水平［15］。但是本试验室目前并未保存有其他血清型的鸭疫里氏杆菌阳性血清，这使得此部分试验未能实施。下一步工作应尽量多收集多种血清型进行试验，证明其是否可以同时与多种血清型的鸭疫里氏杆菌阳性血清发生反应。此外，覃志初等［16］利用间接ELISA检测方法进行ompA蛋白单克隆抗体阳性克隆的鉴定。本课题下一步工作计划即制备ompA单克隆抗体，进行双夹心ELISA检测方法检测RA抗原。

本试验建立的ELISA方法中分别将同批次和不同批次包被的酶标板对4份RA阳性血清进行ELISA检测，每份血清做4个重复，变异系数在1.2%～8.8%之间，因此本试验建立的方法重复性良好，具有稳定性。

试验数据显示，在免疫后第7天鸭血清中的抗体水平开始有上升趋势，说明在鸭体内免疫后7d开始出现免疫反应，随着时间的延长，抗原缓慢释放，抗体水平逐渐升高，在35d抗体水平达到高峰，之后开始下降，在免疫后77d左右抗体水平与免疫后14d的抗体水平相近，为保持较高的抗体水平，应在免疫后77d内进行加强免疫，但是就目前商品鸭养殖模式而言，此抗体水平维持时间已足够。

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