猪圆环病毒ZZ株ORF2基因的克隆及原核表达＊

乔宏兴，张晓根，边传周，宁豫昌

（郑州牧业工程高等专科学校生物工程系，河南郑州 450011）

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV－2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）和相关疾病的重要病原，德国学者Tisher首次在PK－15细胞中发现 PCV－2［1－2］。郎洪武等［3］对国内7个省（市）的559份猪血清进行了检测，猪群PMWS抗体的阳性率为42.9% ，表明该病在中国很多猪场广泛存在，并且与其他猪病毒如猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪蓝耳病病毒等混合感染给养猪业造成了巨大损失，已成为阻碍中国养猪业发展的重要疾病之一。

PCV是一种无囊膜，直径平均为17nm的DNA病毒［4］。PCV－2的基因组全长为1 767bp或1 768bp，这是由于1 042位（位于ORF2）核苷酸的缺失或插入造成的［5］。PCV－2含有两个主要开放阅读框，即ORF1和ORF2，其中ORF1编码复制酶相关的Rep蛋白，该蛋白氨基酸序列比较保守［6］；ORF2编码病毒的主要结构蛋白［7］，是临床分子水平上鉴定PCV－2的重要基因。本研究利用PCR技术从所分离鉴定的PCV－2zz株克隆出ORF2基因序列，将其导入原核表达载体中，进行了表达和检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体与工程菌 大肠埃希菌BL21（DE3）购自Promega公司；载体pET－32a（＋）购自 Novagen公司；各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、分子质量标准Marker购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.2 主要试剂 低分子量标准蛋白（上海生化所）；硝酸纤维素膜（Millipore公司）；HRP标记的羊抗猪二抗（洛阳华美生物公司）；PCV－2阳性血清为经ELISA检测呈阳性的病猪血清，效价为1∶1 024，由郑州牧业工程高等专科学校生物系微生物教研室提供。其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.1.3 PCV－2分离株 由郑州牧业工程高等专科学校生物技术教研室分离鉴定保存，命名为PCV－2 ZZ株。

1.1.4 引物设计与合成 根据PCV－2全基因组国内外 毒株 序 列，设 计1对 引 物，P1：5′－ATGGATCCATCACGAAACCTTGGACCCGAAAGG－3′，P2：5′－ATTCTCGAGTATTGCCAAA AGTCCCGGTCAAATT－3′，引物两端分别加上BamHI和XhoI酶切位点。

1.2 方法

1.2.1 ORF2基因的克隆 按照以下反应体系进行PCR反应（50μL反应体系）：10×buffer 5.0μL，10mmol／L dNTPs 4.0μL，20μmol／L p1 1μL，20μmol／L p2 1μL，2UTaq0.5μL，模板2μL，无菌水36.5μL，反应程序：95℃预变性5min，94℃45s，52℃40s，72℃2min，30个循环，72℃延伸10min。10g／L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 ORF2基因原核表达载体构建 将PCR产物克隆至T载体，提取阳性重组质粒，将阳性重组质粒与pET－32a（＋）原核表达载体用BamHI和XhoI分别进行双酶切，并进行连接，然后转化至BL21感受态细胞中，构建阳性重组质粒pETORF2，将质粒送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。利用DNA Star软件与已公布的PCV－2ORF2基因组序列做进行分析，绘制系统进化树。

1.2.3 ORF2原核表达 将重组BL21菌按1∶100的比例加入含有氨苄（30μg／mL）的LB液体培养基中，37℃条件下振荡培养2h左右，当OD值达到0.4～0.6 时加入终浓 度为 1.0mmol／L 的IPTG，30℃振荡培养3h～4h诱导表达，同时设空载体诱导对照。培养后各取出1mL，12 000r／min离心30s，弃上清。100℃变性3min，SDS－PAGE对表达做出初步鉴定。

1.2.4 Western blot分析 SDS－PAGE后，将蛋白条带转移至醋酸纤维素膜（NC膜）上，将转印膜放入20mL的100mL／L的脱脂奶粉中4℃过夜封闭；将转印膜剪成单条，加入PCV－2多抗，37℃作用30min；PBS液将HRP标记的羊抗猪二抗1∶1 000稀释，加入NC膜上。37℃反应30min，每次反应后均用TBST洗涤3次，最后用AEC做显色。当目的条带与本底显色差别最大时，用水立即终止显色。

2 结果

2.1 目的基因的克隆

从病料中扩增出大小为702bp左右的PCV－2 ORF2特异性条带，与预期相符（图1）。

图1 PCV－2ORF2基因PCR产物Fig.1PCR product of PCV－2ORF2gene

2.2 重组质粒pET－ORF2的双酶切鉴定

将阳性重组质粒用BamHI和XhoI进行双酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果可见载体条带5 900bp和目的条带702bp，与预期结果一致，酶切结果见图2，说明得到阳性重组表达质粒。

图2 重组质粒pET－ORF2的酶切鉴定Fig.2Recombinant plasmid pET－ORF2identified by enzyme digestion

2.3 序列分析

测序结果表明，克隆到的ORF2基因全长为702bp，将其核苷酸序列与已发表的欧洲和北美、中国大陆、台湾地区、日本的24株PCV毒株进行比较分析发现，ZZ毒株与其它地域的PCV－2毒株间的核苷酸序列同源性均在88.2%以上，其中ZZ分离毒与QD的核苷酸序列同源性达100%，表明zz株与QD株可能是在国内引种时来自同一地方，与罗马尼亚毒株核苷酸同源性为99.8%，与国内其他几株毒株II（浙江）、HZ2020（杭州）、GD－TS（广东泰山）、ZS（广州）、JJ（浙江）、SD（山东）、TJ（天津）、HB（河北）毒株及欧洲分离株（德国、罗马尼亚分离株）核苷酸序列较近，形成一个分支表示亲缘关系较近，这也可能与我国从欧洲引种有关。ZZ株与国内SZ（深圳）及美国、加拿大、英国、日本毒株亲缘关系较远（图3）。

2.4 SDS－PAGE电泳检测

诱导表达产物按常规方法进行SDS－PAGE，在30ku左右处出现与预期大小相一致的蛋白条带（图4），而对照样品则没有。

2.5 Western blot分析

用猪PCV－2阳性血清对诱导表达后的菌体蛋白进行Western blot分析，在大小约30ku处出现1条清晰的反应条带，对照组则无（图5），说明表达的重组蛋白可被PCV－2多抗识别。

图3 PCV分离毒株的系统发育进化树Fig.3Phylogenetic tree of PCV isolates

图4 SDS－PAGE电泳分析表达产物Fig.4Analysis of the expressed products by SDS－PAGE

图5 重组蛋白的Western blot分析Fig.5Analysis of the recombinant protein by Western blot

3 讨论

近年来，PCV－2在全世界范围内广泛流行，给养猪业造成的损失惨重，PCV－2能够引起猪体免疫系统的损伤，导致机体产生免疫抑制，引起混合感染或继发其他猪病的发生，易于其他病毒如猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒等混合感染或继发感染，对临床生产造成的经济损失更大［8］。因此，如果能够在较早时期诊断出PCV－2疾病，对猪场的疾病监测具有重要意义［9－10］。

PCV－2基因组大小为1 768bp，包含11个开放ORF［11］，位于正链上的最大开放阅读框ORF1编码与病毒复制有关的蛋白（Rep），位于负链上的ORF2编码病毒的结构蛋白（Cap）。Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳，在病毒感染细胞后在宿主各种酶的参与下产生。研究表明［12］，Cap蛋白在PCV－1与PCV－2间不发生交叉反应，因而可用于区分PCV－1和PCV－2，且具有较好的免疫原性，其编码基因已成为研制疫苗及检测的首选基因［13］。在本研究中，我们克隆出702bp的ORF2片段，并进行了原核表达，Western blot分析表明与PCV－2多抗能够发生反应，为进一步研究PCV－2疫苗、制备快速诊断试剂盒提供了基础。

在本研究中，设计一对引物从分离到的PCV毒株中扩增出ORF2基因，并进行了同源性比较和进化分析。结果表明，ZZ株与QD株核苷酸序同源性为100%，与罗马尼亚毒株同源性为99.8%，与另外一支德国毒株同源性为99.5%，同时和国内其他毒株同源性较高，组成一支。从分析结果可以看出，前几年中国一些猪场盲目从欧洲引种，导致PCV－2的传入，PCV－2进入我国后，基因趋于稳定，但由于各地引种地点、养殖方式不同，各个毒株之间也发生了一定的变异，变异的结果对以后预防和控制PCV－2加大了难度，因此，各个地方应加强疫病的防疫检验工作。

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