线粒体D-loop区单核苷酸多态性与食管鳞状细胞癌患者发病年龄关系的研究

范海燕，李胜棉，张瑞星，杨 华，郭占军*，高咏梅

（1.河北医科大学第四医院消化内科，河北石家庄 050011；2.河北北方学院附属第一医院消化内科，河北张家口 075000）

线粒体D-loop区单核苷酸多态性与食管鳞状细胞癌患者发病年龄关系的研究

范海燕1，李胜棉1，张瑞星1，杨 华1，郭占军1*，高咏梅2

（1.河北医科大学第四医院消化内科，河北石家庄 050011；2.河北北方学院附属第一医院消化内科，河北张家口 075000）

目的探讨线粒体D-1oop区单核苷酸多态性与食管鳞状细胞癌患者发病年龄关系。方法2003—2005年在河北医科大学第四医院完成食管鳞状细胞癌患者线粒体D-1oop区测序55例，单核苷酸多态性与患者发病年龄的关系分析采用Kap1an-Meier法，组间比较使用Log-rank检验。结果经Log-rank检验，单核苷酸多态位点16266C/T基因型与发病年龄有关，多态位点16266T基因型患者发病早于16266C基因型患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论线粒体DNA D-1oop区基因多态性位点可作为食管鳞状细胞癌患者发病年龄的预测标记，同时线粒体D-1oop区多态性位点有助于识别早发的食管鳞状细胞癌患者。

食管肿瘤；多态性，单核苷酸；线粒体

食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一，年发病率＞125/100 000［1］。食管癌的确切病因和发病机制至今尚未明确，到目前为止关于基因和肿瘤发病年龄关系的研究甚少［2-3］。人类线粒体基因组为环状DNA分子，线粒体DNA处在活性氧自由基和其他自由基包围之中，缺乏组蛋白保护，且其内缺乏完整的修复系统，与核内基因相比，线粒体DNA很容易发生突变［4］；近来研究发现在多种肿瘤中可见线粒体DNA存在广泛变异，因此包括食管癌在内的多种肿瘤中线粒体（disp1acement 1oop，D-1oop）区已成为基因突变和多态性研究的热点区域［5］。我们参照线粒体数据库（www.mitomap.org）已经完成食管鳞状细胞癌患者线粒体D-1oop区域的测序，其中共发现了88个单核苷酸多态位点，并且已经探讨了单核苷酸多态位点与食管鳞状细胞癌疾病预后的关系［6-7］；本研究旨在探讨线粒体D-1oop区单核苷酸多态性与食管鳞状细胞癌患者发病年龄的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料：2003—2005年河北医科大学第四医院胸外科住院食管鳞状细胞癌患者55例，均来自中国河北食管癌高发病地区，男性34例，女性21例，年龄39～76岁，平均（59.3±8.56）岁，其中≤40岁患者1例（男性1例），＞40～50岁患者6例（男性5例，女性1例），＞51～60岁患者29例（男性17例，女性12例），＞60岁患者19例（男性11例，女性8例），患者术前未进行任何临床治疗。术前均空腹抽取外周静脉血，外周血标本当天提取线粒体后置于-80℃恒温冰箱保存，病理类型由2名资深病理专家确认。

1.2 研究方法：使用全血线粒体DNA萃取试剂盒迅速提取线粒体DNA，PCR扩增线粒体DNA的D-1oop 区， 上 游 引 物 为 5’ -CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3’，下游引物为5’-GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC-3’，扩增的目的片段长度为982bp，PCR的具体参数参照PCR预混试剂盒说明，将PCR产物纯化测序，测序使用美国ABI PRISM 3100 DNA序列分析仪，同一标本采用双向重复测序，随后检测血标本线粒体D-1oop区单核苷酸多态性。

1.3 统计学方法：应用SPSS11.5软件分析数据，每个单核苷酸多态位点与发病年龄之间的关系分析使用Kap1an-Meier法，组间比较采用Log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

本研究将单核苷酸多态性最小等位基因频率＜5%的位点剔除，共得到16个单核苷酸多态位点进一步分析。基于每个单核苷酸位点基因型的不同将食管鳞状细胞癌患者分为16266T基因型和16266C基因型2组。采用 Kap1an-Meier法，通过 1ogrank检验发现多态位点16266与食管鳞状细胞癌患者的发病年龄之间有关（图1），多态位点16266T基因型患者发病早于16266C基因型患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 16266位点与食管鳞状细胞癌患者发病年龄之间的关系Figure 1 Comparison of age onset of ESCC patients by 16266 genotype in the D-1oop

3 讨 论

以往研究发现在本实验中的线粒体D-1oop区单核苷酸多态位点在多种肿瘤中与致癌风险和疾病预后有关［8］，而本研究进一步发现线粒体D-1oop区一段连续的序列（16190～16583位点）中的单核苷酸多态性与食管鳞状细胞癌患者发病年龄有关（P＜0.05）。

我们已经在消化道肿瘤对线粒体D-1oop区单核苷酸多态性进行了详细研究［8］，本研究首次发现线粒体D-1oop区单核苷酸多态性不只作为致癌风险因素和疾病预后的预测指标，而且对食管鳞状细胞癌患者来说也是发病年龄早晚的一个预测指标，单核苷酸多态位点16266在线粒体基因组中位于MT-5基因和MT3L基因之间，尽管以往我们通过病例对照研究发现其与肝癌患者致癌风险有关［8］，但到目前为止其具体的功能尚不明了，最小等位基因16266T基因型与食管鳞状细胞癌患者早发病有关，本研究结果显示，16266T基因型患者发病年龄曲线迅速下降，患者发病年龄较早。但仍需大量样本继续研究该多态位点与食管鳞状细胞癌患者发病年龄的关系。

线粒体D-1oop区在线粒体基因复制和表达过程中起着重要作用，这个区域内的基因突变有可能影响线粒体DNA复制并导致氧化呼吸链的改变，活性氧自由基大量释放进而损伤细胞核基因组，并最终促使肿瘤的发生和发展［9-10］。本研究发现的单核苷酸多态位点16266有可能使线粒体基因组转录发生改变，基因组转录的改变导致了大量活性氧自由基的产生，这些氧自由基调节机制异常可能促进了肿瘤的发生。

总之，本研究发现线粒体D-1oop区单核苷酸多态性可作为食管鳞状细胞癌患者发病早晚的预测指标，线粒体D-1oop区单核苷酸多态性研究有助于早期对食管鳞状细胞癌患者发病年龄早晚进行分组，进而确定患者的治疗方案。

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（本文编辑：刘斯静）

SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS IN THE MITOCHONDRIAL DISPLACEMENT LOOP AND AGE-AT-ONSET OF ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA

FAN Haiyan1，LI Shengmian1，ZHANG Ruixing1，YANG Hua1，GUO Zhanjun1*，GAO Yongmei2
（1.Department of Gastroenterologt and Hepatologt，the Fourth Hospital of Hebei Medical Universitt，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Gastroenterologt and Hepatologt，the First Attached Hospital of Hebei Northern Institute，Hebei Province，Zhangjiakou 75000，China）

ObjectiveTo investigate the association of age-at-onset of esophagea1 squamous ce11 carcinnoma（ESCC）patients and sing1e nuc1eotide po1ymorpyisms（SNPs）in mitochondria1 D-1oop.MethodsThe D-1oop region of mtDNA was sequenced in 55 ESCC patients recorded in the Fourth Hospita1 of Hebei Medica1 University between 2003 to 2005.The age-at-onset curve was ca1cu1ated with the Kap1an-Meier method and compared by the Log-rank test at each SNP site.ResultsThe SNP sites of nuc1eotides 16266 C/T were corre1ated with age-at-onset by the Log-rank test. The onset age of patients with 16266T genotype was significant1y younger than that of patients with 16266C at the 16266 site（P＜0.05）.ConclusionGenetic po1ymorphisms in the D-1oop are predictive markers for age-at-onset in ESCC patients.According1y，the ana1ysis of genetic po1ymorphisms in the mitochondria1 D-1oop can he1p to identify ESCC patient subgroups at high risk of ear1y onset.

po1ymorphisms，sing1e nuc1eotide；esophagea1 neop1asms；mitochondria1

R735.1

A

1007-3205（2012）04-0391-03

2011-12-20；

2012-03-29

范海燕（1978-），女，河北石家庄人，河北医科大学第四医院主治医师，医学硕士，从事消化系统疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mai1：zjguo5886@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.04.007