老年肥胖者脂肪组织内脂素基因的表达及其相关因素

蒋蓝英，赵 凯，付仲颖，董 斌，孙文丽，何炳荣

（浙江省杭州市红十字会医院老年病科，浙江杭州 310003）

老年肥胖者脂肪组织内脂素基因的表达及其相关因素

蒋蓝英，赵 凯，付仲颖，董 斌，孙文丽，何炳荣

（浙江省杭州市红十字会医院老年病科，浙江杭州 310003）

目的探讨老年肥胖患者腹部网膜及皮下脂肪组织内脂素mRNA的表达情况及其相关因素。方法根据体质量指数不同，将择期腹部手术的老年患者40例分为肥胖组20例，对照组20例。采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法检测内脂素mRNA的表达量，酶联免疫吸附法测定血浆内脂素浓度，稳态模型评估胰岛素抵抗指数（homeostasis mode1 of assessment for insu1in resistant index，HOMA-IR），并分析内脂素与人体测量指标和代谢指标的相关性。结果①2组网膜脂肪组织内脂素mRNA的表达量明显高于皮下脂肪组织内脂素mRNA的表达量（P＜0.05），肥胖组网膜脂肪组织内脂素mRNA的表达量高于对照组（P＜0.05），而2组皮下脂肪组织内脂素mRNA的表达量差异无统计学意义（P＞0.05）；②肥胖组血浆内脂素浓度显著高于对照组（P＜0.05）；③合并2组数据，网膜脂肪组织内脂素mRNA的表达水平与腰臀比、空腹胰岛素、HOMA-IR呈正相关（r=0.264、0.108、0.173，P＜0.05），而皮下脂肪组织未发现任何相关性因素（r=0.099，P＞0.05）；血浆内脂素浓度与总胆固醇呈正相关（r=0.257，P＜0.05），且与网膜脂肪组织内脂素mRNA的表达水平呈正相关（r=0.267，P＜0.05）；④多元逐步回归分析发现，空腹胰岛素是血浆内脂素浓度和网膜脂肪组织内脂素mRNA的独立相关因素。结论内脂素mRNA主要在内脏脂肪组织中表达，可能与肥胖、胰岛素抵抗有关。

肥胖症；内脂素；脂肪组织；老年人

脂肪组织是一个活跃的内分泌器官，能分泌多种脂肪细胞因子，如肿瘤坏死因子α、纤溶酶原激活抑制因子-1、白细胞介素-6、瘦素、抵抗素以及脂联素等，在能量代谢平衡以及多种疾病中发挥着重要的作用［1-2］。内脂素是新近发现的一种新的脂肪细胞因子，主要由内脏脂肪分泌产生，其具有类胰岛素活性，可降低血糖并能促进脂肪的合成与聚集，因此可能是与肥胖有关的一个肽类激素［3］。本研究观察内脂素基因在老年肥胖者和对照者腹部皮下脂肪组织和网膜脂肪组织中表达情况的差异及其与体质量指数（body mass index，BMI）、腰围、血压、空腹血糖（fasting b1ood g1ucose，FBG）、空腹胰岛素（fasting insu1in，FINS）、血脂、稳态模型评估胰岛素抵抗指数（homeostasis mode1 of assessment for insu1in resistance index，HOMA-IR）、血浆内脂素的关系，探讨内脂素在老年肥胖者和胰岛素抵抗中的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料：2009年1—12月浙江省杭州市红十字会医院因胆石病、慢性胆囊炎、肝血管瘤等择期腹部手术的老年患者40例，排除恶性肿瘤、急性炎症患者，无使用糖皮质激素、性激素、胰岛素、降脂药等药物病史。采用2000年亚太地区成人肥胖的分类标准［4］，BMI≥25kg/m2为肥胖，≤23kg/m2为正常体质量，其中肥胖组20例，男性14例，女性6例，年龄60～77岁，平均（65.0±3.7）岁；对照组（正常体质量）20例，男性14例，女性6例，年龄60～78岁，平均（64.8±3.0）岁。均签署知情同意书，在手术过程中取花生米大小的皮下脂肪和大网膜脂肪各1块，-80℃液氮迅速冻存，用于RNA提取。

1.2 内 脂 素：mRNA 检 测 用 TRIZOL（INVITROGEN公司）提取脂肪组织总RNA，UV-754紫外发光光度计测定其浓度和含量，标本总RNA A260与A280比值均为1.8～2.0。依据逆转录试剂盒（TAKARA日本）说明操作，获取cDNA后，用无RNase的DNase处理，去除可能的基因组DNA污染。引物的设计与合成，根据Genbank上报道的人内脂素基因与 β-actin基因序列［3］，利用Primer-5引物设计软件设计。以肌动蛋白（βactin）基因作为内参照基因，其引物（186bp），上游，5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’；下游，5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’。内脂素为目的基因，其引物（216bp），上游，5’-TCCTGGCCACCGACTCCTA -3’；下游，5’-TTTGGCTTCCTGGATTTTCTCT-3ˋ引物由浙江荧光泰生物技术公司合成。

实时荧光定量PCR反应体系，SYBRRGreen I PCR Master Mix 12.5μL，10μmo1/L上下游引物各0.5μL，模板 2.0μL，总体积为25μL；以 NTC（no temp1ate contro1）、NRTC（no reverse-transcript contro1）为阴性对照。反应条件，95℃5 min，94℃、15s→60℃、45s，循环扩增40次，60℃测定荧光值，熔解曲线，仪器为美国ABI的ABI 7500型实时荧光定量PCR仪，结果由仪器配套的软件分析，采用比较阈值法来测定目的基因的相对表达，目的基因的相对表达量 =2t-△△C，△△Ct=（△Ct，目的基因-△Ct，内参基因）实验组-（△Ct，目的基因-△Ct，内参基因）对照组。

C（tthresho1dcyc1e）值为PCR反应时，随着PCR产物逐渐增多，荧光强度不断增强，当达到一定的阈值被仪器检测到时的循环数。2t-△△C表示的是肥胖组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到目的基因相对于内参基因的定量。

1.3 测量指标：血压（mmHg）、身高（m）、体质量（kg）、腰围（waist circumference，WC）（cm）、臀围（hip circumference，HC）（cm），计算BMI及腰臀比（waist to hip ratio，WHR），BM1=体质量（kg）/身高（m）2；WHR=腰围（cm）/臀围（cm）。

1.4 血液标本的收集及测定：患者隔夜空腹10～12h采集静脉血，一份血清立即测定FPG、FINS、血脂，一份加入乙二胺四乙酸抗凝管混匀，立即送实验室，4℃离心（3 500r/min）3min，分离的血浆冻存于-80℃冰箱，用于血浆内脂素浓度测定。血浆内脂素浓度测定，采用ELISA法，线性范围为4～256μg/L，批内变异系数（coefficient of variation，CV）＜5%，批间CV＜14%。用Curve Expert 1.3软件制作半对数标准曲线图并处理数据，得到标本血浆内脂素浓度。血脂测定，总胆固醇（tota1 cho1estero1，TC）、三酰甘油（trig1yceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（highdensity 1ipoprotein cho1estero1，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（1ow-density 1ipoprotein cho1estero1，LDLC）采用酶法测定；FPG测定采用葡萄糖氧化酶一过氧化物酶酶联法，由日本奥林巴斯AU1000全自动生化分析仪检测。FINS测定化学发光法，由德国罗氏E-170型全自动电化学发光分析仪检测。糖化血红蛋白测定采用高压液相。

1.5 统计学方法：应用SPSS17.0统计软件进行统计分析。计量资料以±s表示，两样本间比较采用独立样本t检验和配对t检验，相关性采用直线相关分析和多元线性逐步回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床参数及生化资料比较：肥胖组BMI、WC、WHR、FINS、HOMA-IR、TG、血浆内脂素（visfastin）浓度显著高于对照组（P＜0.01，P＜0.05），2组年龄、收缩压（systo1ic b1ood pressure，SBP）、舒张压（diasto1ic b1ood pressure，DBP）、FBG、TC、LDL-C、HDL-C差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 肥胖组和对照组临床与实验室参数比较Table 1 Analysis of clinic and laboratory data between obesity group and control group（n=20，±s）

表1 肥胖组和对照组临床与实验室参数比较Table 1 Analysis of clinic and laboratory data between obesity group and control group（n=20，±s）

*P＜0.05 #P＜0.01 vs contro1 group by t testBMI：body mass index；WC：waist circumference；WHR：waist-hip ratio；SBP：systo1ic b1ood pressure；DBP：diasto1ic b1ood pressure；FBG：fasting b1ood g1ucose；FINS：fasting insu1in；HOMA-IR：homeostasis mode1 of assessment for insu1in resistence index；TC：tota1 cho1estero1；TG：trig1yceride；LDL-C：1ow-density 1ipoprotein cho1estero1；HDL-C：high-density 1ipoprotein cho1estero1

Groups Age（years）BMI［m·A/kg·（m2）-1］ （L/cm） WHR SBP（P/mmHg）WC DBP（P/mmHg）FBG（c/mmo1·L-1）.02 133.4±11.6 77.8±5.7 5.45±0.86 Obesity 65.6±7.3 25.98±0.80# 89.0±2.4# 0.91±0.06#Contro1 64.8±8.0 21.97±0.79 79.1±3.4 0.88±0 135.6±7.8 76.4±5.1 5.81±0.76 Groups FINS（mU/L） HOMA-IR TC（c/mmo1·L-1）TG（c/mmo1·L-1）LDL-C（c/mmo1·L-1）HDL-C（c/mmo1·L-1）Visfastin（ρ/μg·L-1）±0.29 3.00±0.76 1.20±0.19 16.54±2.54 Obesity 14.06±3.32# 3.67±1.15# 5.13±0.71 1.78±0.31* 3.19±0.74 1.13±0.22 18.16±2.93 Contro1 11.41±1.18 2.77±0.57 4.92±0.77 1.60 *

2.2 内脂素mRNA实时定量PCR：与皮下脂肪组织内脂素mRNA表达量相比，对照组及肥胖组网膜脂肪组织内脂素mRNA表达量均明显增高（P＜0.05），肥胖组网膜脂肪组织内脂素mRNA表达量显著高于对照组（P＜0.05），而肥胖组与对照组皮下脂肪组织内脂素mRNA表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2，图1。

2.3 相关性分析：血浆内脂素与TC（r=0.257，P＜ 0.05）、网膜脂肪组织内脂素 mRNA表达量（r= 0.279，P＜0.05）呈正相关，而与皮下脂肪组织内脂素mRNA表达量无相关性（r=0.099，P＞0.05）；皮下脂肪组织内脂素mRNA表达量与网膜脂肪组织内脂素mRNA的表达量呈正相关（r=0.771，P＜0.01），网膜脂肪组织内脂素 mRNA表达量与WHR、FINS、HOMA-IR呈正相关（r=0.264、0.108、0.173，P＜0.05）。

表2 肥胖组和对照组内脂素mRNA实时荧光定量PCR结果Table 2 The results of adipose tissue visfatin mRNA expression using real time PCR in obesity and control groups（n=20，±s）

表2 肥胖组和对照组内脂素mRNA实时荧光定量PCR结果Table 2 The results of adipose tissue visfatin mRNA expression using real time PCR in obesity and control groups（n=20，±s）

*P＜0.05 vs subcutaneous adipose tissue #P＜0.05 vs omenta1 adipose tissue in contro1 group by t test

Groups Ctβ-actin Ctvisfatin △Ct △△Ct 2-△△Ct（95%CI）Subcutaneous adipose tissue Contro1 21.39±1.29 31.87±1.34 10.47±0.72 0.00±0.72 1.0（0.61～1.65）Obesity 21.42±1.12 31.94±1.40 10.51±0.63 0.05±0.63 0.97（0.67～1.60）Omenta1 adipose tissue Contro1 21.37±1.22 30.26±1.25 8.89±0.60 -1.57±0.89 2.97（1.60～5.50）*Obesity 21.41±1.23 29.85±1.21 8.48±0.50 -1.98±0.93 3.94（1.04～7.52）*#

图1 各脂肪组织相对于对照组皮下脂肪组织内脂素mRNA表达示意图A.对照组皮下；B.肥胖组皮下；C.对照组网膜；D.肥胖组网膜脂肪组织*P＜0.05与对照组皮下脂肪组织内脂素比较 #P＜0.05与对照组网膜脂肪组织mRNA比较（t检验）Figure 1 Visfatin mRNA expressions of different adipose tissue compared to subcutaneous adipose tissue of contro1A.Subcutaneous adipose tissue in contro1 group；B.Subcutaneous adipose tissue in obesity group；C.Omenta1 adipose tissue in contro1 group；D. Omenta1 adipose tissue in obesity group*P＜0.05 vs expression of visfatin mRNA in subcutaneous adipose tissue in contro1 group #P＜0.05 vs expression of visfatin mRNA in omenta1 adipose tissue in contro1 group by t test

2.4 多元逐步回归分析：以年龄、BMI、WC、WHR、SBP、DBP、FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、HDL-C为自变量，分别以血浆内脂素浓度、皮下脂肪组织内脂素mRNA表达量、网膜脂肪组织内脂素mRNA表达量作为因变量，进行多元线性逐步回归分析，显示FINS是血浆内脂素浓度和网膜脂肪组织内脂素mRNA的独立相关因素（r=0.619、0.267，P＜0.01，P＜0.05）。

3 讨 论

肥胖症是一种以体脂的过度堆积和异常分布为特征的内分泌代谢疾病，可增加2型糖尿病、高血压和冠心病等相关疾病的危险性，已逐渐成为21世纪影响人们健康的主要问题之一。流行病学证据显示，网膜脂肪较皮下脂肪堆积具有更大的危险性［5］，因此体脂的分布可能比体脂的总量显得更为重要。

内脂素是新发现的一个脂肪细胞因子，具有拟胰岛素活性，可降低血糖并能促进脂肪的合成与聚集。近年来发现内脂素与网膜脂肪含量强相关［6］，表明与腹型肥胖关系密切。本研究针对老年人群，系统研究了老年肥胖人群网膜及皮下脂肪组织中内脂素mRNA表达的差异以及与体脂、血脂、血糖、胰岛素等指标的相关性。

本结果显示，老年肥胖组和对照组网膜脂肪组织内脂素mRNA的表达显著高于皮下脂肪组织，且肥胖组网膜脂肪组织内脂素mRNA的表达明显高于对照组，而2组皮下脂肪组织内脂素mRNA的表达差异无统计学意义；另外，血浆内脂素的浓度与网膜脂肪组织内脂素mRNA的表达水平呈正相关，而与皮下脂肪组织内脂素mRNA的表达水平没有相关性。均提示内脂素主要在内脏脂肪组织中表达，与Fukuhara等［3］研究结果一致。

本文老年肥胖组血浆内脂素浓度显著高于对照组；网膜脂肪组织mRNA的表达水平与WHR呈正相关，而皮下脂肪组织内脂素mRNA的表达水平与此无明显相关。Chen等［7］发现内脂素与WHR呈正相关，且WHR是血浆内脂素水平的独立相关因素，这也进一步提示内脂素与内脏脂肪之间存在紧密联系，即内脏脂肪的含量越多，内脂素基因表达水平越高。本文肥胖组TC浓度显著高于对照组，相关分析显示血浆内脂素浓度与TC呈正相关，提示血浆内脂素与腹型肥胖、脂代谢紊乱有关。

本组网膜脂肪组织内脂素mRNA表达水平与FINS、HOMA-IR呈正相关，多元线性逐步回归分析，空腹胰岛素是血浆内脂素浓度和网膜脂肪组织内脂素mRNA表达水平的独立相关因素，提示网膜脂肪组织内脂素基因表达与FINS水平相关，与胰岛素抵抗有一定的相关性。因内脂素的特征与胰岛素有相同之处，所以对内脂素的生理作用的进一步研究可能对糖代谢稳定产生新的认识，为糖尿病的治疗找到新的方法。

但国外有关内脂素的研究亦有不同的结论。K1oting等［8］对肥胖WOKW大鼠与消瘦DA大鼠进行研究，发现两者内脂素mRNA表达水平差异无统计学意义，且未发现其在肥胖WOKW大鼠与消瘦DA大鼠的内脏脂肪中上调。Berndt等［9］研究发现，血浆内脂素浓度与网膜脂肪量之间无相关性，皮下脂肪与网膜脂肪内脂素基因表达水平差异无统计学意义。Bottcher等［10］进行的内脂素基因多态性与糖、脂代谢相关性研究中发现，内脂素基因的变化在2型糖尿病、肥胖等疾病的发生中作用不大。考虑与各研究者选择的实验对象及样本量不同、实验方法不一致有关。总之，对老年肥胖患者内脂素基因表达水平和血浆浓度变化的研究表明，该脂肪细胞因子与肥胖的发生发展有关，可能在脂质代谢紊乱所引起疾病的发生发展中起作用，但其作用机制还需进一步研究。

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［10］ BOTTCHER Y，TEUPSER D，ENIGK B，et a1.Genetic variation in the visfatin gene（ PBEF1）and its re1ation to g1ucose metabo1ism and fat-depot-specific messenger ribonuc1eic acid expression in humans［J］.J C1in Endocrino1 Metab，2006，91（7）：2725-2731.

（本文编辑：赵丽洁）

EXPRESSION OF VISFATIN mRNA IN ADIPOSE TISSUES AND RELATED FACTORS IN SENILE OBESITY SUBJECTS

JIANG Lanying，ZHAO Kai，FU Zhongying，DONG Bin，SUN Wen1i，HE Bingrong
（ Department of Gerontologt，Hangzhou Red Cross Hospital，Zhejiang Province，Hangzhou 310003，China）

ObjectiveTo investigate the expression of visfatin mRNA in subcutaneous and omenta1 adipose tissue and re1ated factors in seni1e obesity subjects.MethodsForty seni1e patients of surgery were divided into obese group and norma1 group（n=20 for each）according to body mass index. The expression of visfatin mRNA in abdomina1 subcutaneous and omenta1 adipose tissue was measured by rea1-time f1uorescent quantitative reverse transcription-po1ymerase chain reaction（RT-PCR）assay，p1asma visfatin was measured by enzyme-1inked immunosorbent assay（ELISA），and fasting b1ood g1ucose，fasting insu1in（FINS），b1ood 1ipid profi1es and homeostasis mode1 of assessment for insu1in resistant index（HOMA-IR）were determined.Results①There was no statistica1 difference of visfatin mRNA expression in subcutaneous adipose tissue between obese subjects and contro1s.Visfatin mRNA expression 1eve1s in omenta1 adipose tissue were significant1y increased in obese subjects and contro1s than those in subcutaneous tissue respective1y（P＜0.05），visfatin mRNA expression in omenta1 adipose tissue was significant1y higher in obese group than in contro1 group，and visfatin mRNA expression was not significant1y different between obese subjects and contro1s.②P1asma visfatin 1eve1s were e1evated in obesesubjects compared with contro1s（P＜0.05）.③The expression 1eve1 of visfatin mRNA in a11 omenta1 adipose tissue was positive1y corre1ated with waist-hip ratio，fasting insu1in，HOMA-insu1in resistance. However the expression 1eve1 of visfatin mRNA in a11 subcutaneous adipose was not corre1ated with any factors.P1asma visfatin 1eve1s were positive1y corre1ated with tota1 cho1estero1 and visfatin mRNA expression 1eve1s in omenta1 adipose tissue.④Mu1ti-stepwise regression ana1ysis demonstrated that the expression 1eve1 of visfatin mRNA in a11 omenta1 adipose tissue and p1asma visfatin 1eve1s were significant1y corre1ated with FINS.ConclusionVisfatin mRNA expression is main1y in omenta1 adipose tissues and may be re1ated to obesity or insu1in resistance.

obesity；visfatin；adipose tissue；aged

R589.2

A

1007-3205（2012）04-0386-05

2011-11-04；

2011-12-28

浙江省杭州市医药卫生科技计划项目（2007B0045）

蒋蓝英（1979-），女，浙江义乌人，浙江省杭州市红十字会医院主治医师，医学硕士，从事内分泌代谢性疾病诊治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.04.005