微波制备IFN-γ处理的小鼠H22肝癌瘤苗免疫荷瘤鼠的抗瘤作用

杨晓峰，杨新宏，朱艳菊，丁晓旭，卢冬梅，孙立新

（承德医学院附属医院小儿外科，河北承德 067000）

微波制备IFN-γ处理的小鼠H22肝癌瘤苗免疫荷瘤鼠的抗瘤作用

杨晓峰，杨新宏*，朱艳菊，丁晓旭，卢冬梅，孙立新

（承德医学院附属医院小儿外科，河北承德 067000）

目的探讨用微波方法制备干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）处理的小鼠H22肝癌细胞瘤苗（microwave and IFN-γtreated H22 tumor cellsmaking H22 tumor vaccine，MITTV-H22）激发机体的抗肿瘤免疫反应。方法小鼠皮下接种H22肿瘤细胞，同时于肿瘤接种部位皮下接种MITTV-H22进行免疫治疗。观察2组小鼠的生存期，治疗结束后取瘤称质量、测瘤体积、计算体积抑瘤率和质量抑瘤率、观察瘤组织病理切片。结果①实验组小鼠的平均生存期为46.5d，对照组小鼠的平均生存期为34.0d（P＜0.05）。②实验组小鼠的瘤块体积增长速度明显慢于对照组（F=179.318，P＜0.0）。③实验组小鼠的平均瘤体积、平均瘤质量小于对照组。④实验组的体积抑瘤率为（57.80±18.40）%，质量抑瘤率为（62.65±23.53）%。⑤实验组肿瘤组织坏死明显增多，大片坏死组织中可见散在成团或岛屿状的残留瘤细胞，淋巴细胞多见，瘤体周边纤维母细胞明显增生。对照组肿瘤组织中瘤细胞增生活跃，局部可见小片状坏死灶，肿瘤细胞间淋巴细胞极少见，瘤体周边有很少或未见纤维母细胞增生。结论MITTV-H22对H22细胞型肝癌具有较强的治疗作用。

肝肿瘤；癌症疫苗；干扰素γ，重组；小鼠

目前肿瘤治疗最具吸引力的生物学方法之一是肿瘤疫苗，由于肿瘤的抗原性较弱，难以激起机体足够的抗肿瘤免疫反应，且肿瘤细胞表达多种肿瘤抗原，针对某个或某些表位产生的免疫应答不能有效地抑制肿瘤细胞的生长，全细胞瘤苗可表达多种肿瘤抗原。根据干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）增强肿瘤细胞的抗原递呈能力，微波修复抗原提高病理切片的抗原性的原理，我们用IFN-γ处理H22肿瘤细胞，再用微波制备全细胞瘤苗，既消除了其致瘤性，又增强了其抗原性，且操作简单。前期我们已经做过用小鼠H22肝癌细胞瘤苗（microwave and IFN-γtreated H22 tumor cells making H22 tumor vaccine，MITTV-H22）对H22细胞型肝癌的预防作用，结果实验组小鼠于H22肿瘤细胞攻击后的7d左右接种部位没有发现肉眼可见的包块，经解剖肿瘤接种部位未发现瘤组织。对照组于H22肿瘤细胞接种后第5或6天接种部位出现直径＜0.5cm的包块，成瘤率为100%，接种后7d平均瘤体积为（4.8±1.0）mm3。观察120d，对照组小鼠平均生存期为（31.87±5.87）d，实验组为（115.40±11.22）d，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。因此我们想进一步观察MITTV-H22对H22细胞型肝癌的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 动物、细胞来源：健康的BALB/C小鼠60只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量14～16g，8周龄，正常饲养。H22瘤株由白求恩医科大学提供，液氮冻存。使用时由液氮中取出，37℃水浴融解后，RPMI-1640培养液洗3遍，接种于含10%胎牛血清的1640培养基，培养至对数生长期，收集细胞接种于BALB/C小鼠腹腔传代。

1.2 MITTV-H22的制备：收集BALB/C小鼠腹水H22肿瘤细胞，1640培养液洗2遍，用H22肿瘤细胞培养液培养，加入IFN-γ（200U/mL），37℃、5%CO2共培养48h［1］。收集H22肿瘤细胞，生理盐水洗2遍，制成2.5×106/mL的H22细胞悬液，微波照射20s（750W、2 450MHz），经台盼蓝染色后光镜下观察证实H22肿瘤细胞已被全部灭活，制成MITTV-H22，4℃储存备用。

1.3 实验分组与动物模型的制备：60只小鼠检疫10d后随机分成2组，实验组（A、C、E）与对照组（B、D、F），每组各30只，每个亚组各10只。每组小鼠右腋皮下接种H22肿瘤细胞（1×106个），同时实验组于肿瘤接种部位皮下接种MITTV-H22（2.5× 106/mL）0.2mL进行免疫治疗，每隔2天免疫1次，共6次，对照组用生理盐水代替MITTV-H22进行治疗对照。A、B 2组用于观察小鼠的生存期。C、D 2组于肿瘤接种后的第6天开始用游标卡尺测量瘤体积，每隔2天1次，共6次，画肿瘤生长曲线。E、F 2组治疗6次后，取瘤块称质量、测体积、观察病理切片。

1.4 实验指标的检测

1.4.1 瘤体积观察：2组于肿瘤接种后的第6天开始用游标卡尺测量瘤体积，每隔2天1次，共6次。MITTV-H22治疗6次后，取2组的瘤块，测量瘤体积、电子天平称质量。瘤块体积的计算公式为，V= 0.4×a×b2（a为瘤块长轴，b为瘤块短轴）。质量抑瘤率=（对照组平均瘤块质量-实验组平均瘤块质量）/对照组平均瘤块质量。体积抑瘤率=（对照组平均瘤块体积-实验组平均瘤块体积）/对照组平均瘤块体积。

1.4.2 瘤体病理切片观察：MITTV-H22治疗6次后，取实验组与对照组的瘤块，用流水洗去组织表面的黏液及血液，然后投入有足量10%甲醛的容器中，固定时间不少于24h，进行HE染色。

1.5 统计学方法：应用SPSS15.0软件进行数据分析，计量资料以±s表示，分别采用重复测量设计的方差分析和t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

实验组小鼠的平均生存期为46.5d，对照组小鼠的平均生存期为34.0d（t=6.96，P＜0.05）。实验组不同时点小鼠的瘤块体积明显小于对照组，差异有统计学意义（F=179.32，P＜0.05）。见表1。

表1 实验组与对照组肿瘤体积的变化

实验组小鼠的平均瘤体积为（0.67±0.21）cm3，小于对照组的（1.84±0.74）cm3，差异有统计学意义（t=4.78，P＜0.05）。实验组小鼠的平均瘤质量为（0.67±0.35）g，低于对照组的（1.91±0.34）g，差异有统计学意义（t=7.96，P＜0.05）。实验组的体积抑瘤率为（57.80±18.40）%，质量抑瘤率为（62.65±23.53）%。

HE染色瘤体病理学观察，实验组肿瘤组织坏死明显增多，大片坏死组织中可见散在成团或岛屿状的残留瘤细胞，淋巴细胞多见，瘤体周边纤维母细胞明显增生。对照组肿瘤组织中瘤细胞增生活跃，局部可见小片状坏死灶，肿瘤细胞间淋巴细胞极少见，瘤体周边有很少或未见纤维母细胞增生（图1～ 6）。

3 讨 论

目前，肿瘤疫苗是肿瘤治疗最具吸引力的生物学方法，但肿瘤疫苗最大的潜在问题是肿瘤抗原的免疫原性弱，机体免疫系统不能识别肿瘤细胞，从而无法彻底杀灭肿瘤。因此，提高肿瘤疫苗抗原的表达是提高宿主对肿瘤细胞免疫反应的关键。

绝大多数强免疫原性肿瘤引起细胞介导的免疫反应，T细胞分泌肿瘤特异性IFN-γ，肿瘤溶解坏死；而弱免疫原性或所谓的非免疫原性肿瘤则无抗瘤效应，肿瘤继续生长。主动特异性免疫（自体疫苗）治疗的策略就是使弱免疫原性肿瘤通过佐剂等手段予以修饰，增强其免疫原性，由免疫无效转化为抗瘤反应［2］。

研究［3］发现，大多数肿瘤表面抗原减弱、细胞表面主要组织相容性抗原（major histocompatibilty complex classⅠ，MHC-Ⅰ）类分子的表达下调或丢失，导致免疫细胞的应答无能是肿瘤细胞普遍存在的生物学现象，也是导致肿瘤细胞逃逸机体免疫监视，逃逸特异性CTL抗肿瘤免疫应答的重要机制。IFN-γ是调节MHC-Ⅰ类抗原高表达的一个重要生物因子［4-6］，能直接抑制肿瘤细胞增殖，增加表面MHC抗原和肿瘤坏死因子的表达、抗肿瘤血管生成等［7］。

肿瘤细胞逃避机体的免疫攻击的另一原因是肿瘤细胞表面“抗原覆盖”或被封闭，因而肿瘤抗原不能被宿主的淋巴细胞所识别，不能有效地被杀伤。微波作为抗原修复的方法已广泛应用于免疫组织化学染色的抗原暴露，是最敏感的抗原修复方法［8-9］。它可以使病理切片的抗原更充分暴露，提高免疫组织化学染色的敏感性。用微波处理恶性肿瘤细胞，制成瘤苗免疫小鼠，将有助于增强小鼠的抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长。

本研究中实验组小鼠的生存期高于对照组，实验组小鼠的瘤质量和瘤体积均小于对照组。瘤体组织学观察，实验组小鼠皮下肿瘤组织大面积坏死，肿瘤周边有较丰富的纤维母细胞及较多的淋巴细胞浸润；而对照组小鼠的瘤组织有灶状坏死，肿瘤周边没有或有很少纤维母细胞，淋巴细胞浸润也少见。推测肿瘤大面积坏死和体积、质量小可能与肿瘤组织中大量淋巴细胞的浸润和纤维母细胞增生有关。进一步推测MITTV-H22免疫可能促进淋巴细胞浸润和纤维母细胞的增生。（本文图见封二）

［1］ LU M，LOHRENGEL B，HILKEN G，et al.Woodchuck gamma interferon upregulates major histocompatibility complex class itranscription but is unable to deplete woodchuck hepatitis virus rep lication intermediates and RNAs in persistently infected woodchuck primary hepatocytes［J］.J Virol，2002，76（1）：58-67.

［2］ SHU S，COCHRAN AJ，HUANG RR，et al.Immune responses in the draining lymph nodes against cancer：implications for immunotherapy［J］.Cancer Metastasis Rev，2006，25（2）：233-242.

［3］ MARINCOLA FM，JAFFEE EM，HICKLIN DJ，et al.Escape of human solid tumors from T-cell recognition：molecular mechanisms and functional significance［J］.Adv Immunol，2000，74（1）：181-273.

［4］ ROMIEU-MOUREZ R，FRANCOIS M，ABATE A，et al. Mesenchymal stromal cells expressing ErbB-2/neu elicit protective antibreast tumor immunity in vivo，which is paradoxically suppressed by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha priming［J］.Cancer Res，2010，70（20）：7742-7747.

［5］ WU TH，SCHREIBER K，ARINA A，et al.Progression of cancer from indolent to aggressive despite antigen retention and increased expression of interferon-gamma inducible genes［J］.Cancer Immun，2011，11（2）：1-12.

［6］ LADHOFF J，FLEISCHER B，HARA Y，et al.Immune privilege of endothelial cells differentiated from endothelial progenitor cells［J］.Cardiovasc Res，2010，88（1）：121-129.

［7］ PAUN A，PITHA PM.The innate antiviral response：new insights into a continuing story［J］.Adv Virus Res，2007，69（1）：1-66.

［8］ KAHVECI Z，MINBAY FZ，NOYAN S，et al.A comparison of microwave heating and proteolytic pretreatment antigen retrieval techniques in formalin fixed，paraffin embedded tissues［J］. Biotech Histochem，2003，78（2）：119-128.

［9］ EVKE E，MINBAY FZ，TEMEL SG，et al.Immunohistochemical detection of p53 protein in basal cell skin cancer aftermicrowaveassisted antigen retrieval［J］.JMol Histol，2009，40（1）：13-21.

（本文编辑：刘斯静）

本刊关于对作者所投稿件查重的说明

为了保证杂志的质量，我们将采用科技期刊学术不端文献检测系统对作者所投稿件查重，凡不符合要求的稿件一律退稿。故要求作者务必以电子邮件的形式投稿，本刊投稿信箱为hbydxb@126.com，电子版稿件中需注明作者的联系方式（手机号及E-mail）。今后本刊编辑部不再受理作者的纸质稿件。

敬请理解与合作！

·本刊编辑部·

R735.7

B

1007-3205（2012）07-0808-03

2011-11-30；

2012-02-01

杨晓峰（1975-），男，满族，河北滦平人，承德医学院附属医院主治医师，医学学士，从事小儿外科疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail：caccine.tumor@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.07.023