黄芩素对大鼠肾间质纤维化的干预作用及对肾组织中TGF-β1和Smad-2表达的影响

王文玉，郭 孜，孙淑军，戴建业，曹慧娟，郑宁宁，房军伟，苟小军，陆 雄，张永煜*

(1.上海中医药大学中医方证与系统生物学研究中心，上海 201203；2.上海中医药大学附属曙光医院 肝病所，上海 201203；3.上海中医药大学科技实验中心 光镜室，上海 201203)

黄芩为唇形科植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，具有清热燥湿，泻火解毒，止血安胎等功效。已有研究[1-3]报道，黄芩及黄芩提取物具有抗肝、肺纤维化的作用，黄芩总苷元提取物对于氯化汞所致大鼠肾纤维化也具有一定改善作用[4]。目前临床上尚无专门治疗肾纤维化的药物,而研究表明黄芩及其提取物有一定抗纤维化的作用。本研究主要观察黄芩素对单侧输尿管结扎(Unilateral Ureteral Obstruction,UUO)所致大鼠肾纤维化的干预作用，并利用免疫组织化学技术对肾组织中TGF-β1和Smad-2表达的影响进行研究，以期寻找一种治疗肾纤维化的有效物质。

1 实验材料

1.1 药品与试剂 黄芩素(陕西慈缘生物技术有限公司，98%)，科素亚(杭州默沙东制药有限公司)，羟脯氨酸试剂盒，单克隆小鼠TGF-β1抗体，多克隆兔Smad-2抗体，SABC试剂盒(SA1022，兔IgG-KIT)，SABC试剂盒(SA1021，小鼠IgG-1/2KIT)，DAB显色试剂盒，苏木素染液，磷酸盐PBS缓冲液(pH 7.4～7.6)，柠檬酸盐缓冲液，中性树胶，二甲苯。

1.2 动物及分组 SD雄性大鼠，体质量(160±10)g,由复旦大学实验动物中心提供,40只，适应性饲养1周后随机分为5组，每组8只：假手术组、模型组、科素亚(阳性药)治疗组20 mg/(kg·d)、黄芩素高剂量组200 mg/(kg·d)、黄芩素低剂量组100 mg/(kg·d)。

2 实验方法

2.1 动物造模及处理 除假手术组外,其他4组行单侧输尿管结扎。手术当天给药，分别灌胃10 d,假手术组和模型组以等容积的0.5%CMC-Na代替。处死大鼠前1 d收集24 h尿液并记录尿量。大鼠腹腔注射麻醉后仰卧位固定，经腹主动脉采血，分离血清。摘取左侧肾脏，留取部分用10%福尔马林固定，部分用于羟脯氨酸含量测定。

2.2 生化指标测定 将所分离的血清及尿液各取100 μL,分别按各个检测指标说明书的操作方法，测定血清Scr，BUN，尿液Cr，肾脏组织Hyp含量，并计算内生肌酐清除率。

2.3 组织病理学观察 将10%福尔马林固定后的肾脏组织石蜡包埋,行HE和天狼星红染色，光镜观察其病理改变。

2.4 免疫组化观察肾组织TGF-β1、Smad-2表达 采用SABC法,按试剂盒说明进行操作。

3 结果

3.1 对大鼠肾功能的影响 见表1。

3.2 对大鼠肾组织Hyp含量的影响 见表2。

表1 对大鼠肾功能Scr、BUN、内生肌酐清除率的影响(±s)

表2 对大鼠肾组织Hyp含量的影响(±s)

3.3 组织病理学观察 见图1，图2。

HE染色见图1，假手术组结构正常，肾间质无改变，肾小管上皮细胞排列整齐,细胞结构完整，小管与小管之间间隙紧密，小管间质无炎性细胞浸润；模型组大量肾小管上皮细胞肿胀、脱落坏死、部分肾小管明显萎缩、部分肾小管明显扩张，炎症细胞浸润；科素亚组见少量的炎性细胞浸润以及纤维组织增生，肾小管轻度扩张，部分肾小球轻度萎缩，肾小囊扩张，但还保留着一部分正常的小管和小球结构；黄芩素治疗组肾脏炎性细胞浸润及间质损伤轻于同期模型组。

天狼星红染色见图2,假手术组可见肾小管间质染色较少；模型组可见肾小管扩张，肾间质明显增宽，胶原大量沉积，尤以髓质明显；科素亚组、黄芩素治疗组较模型组，肾纤维化程度明显降低。

3.4 对各组大鼠肾组织中TGF-β1和Smad-2表达的影响 见表3。

表3 各组大鼠肾组织TGF-β1和Smad-2含量的比较(±s)

4 讨论

肾间质纤维化几乎是所有肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同病理途径。临床上，输尿管梗阻是导致肾间质纤维化最终至肾衰竭的常见原因之一。

本实验研究中，在手术后第10天，模型组大鼠梗阻侧肾脏显著增大肿胀，严重出现积水，包膜显著增厚，科素亚治疗组较模型组大鼠肿胀及积水情况减轻，且包膜较薄，黄芩素治疗组梗阻侧肾脏肿大及积水程度较轻，色泽较红润，说明各治疗组均可以改善梗阻侧肾脏积水及肿胀程度。在UUO造模第10天时,模型组大鼠血肌酐(Scr)、血清尿素氮(BUN)和肾组织羟脯氨酸含量(Hyp)均高于假手术组，内生肌酐清除率(Ccr)明显低于假手术组，提示已造成肾脏损伤。光镜下观察到模型组已出现纤维化，而各给药组对纤维化有改善作用。

综上所述，黄芩素可明显改善梗阻侧肾脏的肿胀及积水情况，在生化指标方面可改善大鼠血清肾功能，在病理形态学方面可明显减轻肾小管间质的损伤程度、间质纤维化程度及淋巴单核细胞的浸润情况。近年的研究发现，肾纤维化的发生发展过程由多种因素参与，涉及多种细胞因子、生长因子和细胞外基质的调节等。TGF-β1是肾纤维化的关键因素,Smad蛋白是TGF-β家族信号从受体到核的细胞内转导分子,TGF-β1/Smad信号转导通路在肾纤维化的发生发展中起重要作用[5-6]。通过免疫组化方法发现，黄芩素可显著降低肾组织中TGF-β1和Smad-2的蛋白表达，表明黄芩素可能通过抑制TGF-β1/Smad信号转导通路来发挥抗肾纤维化作用。

总之，黄芩素可改善肾脏损伤，对肾脏有一定保护作用，但不能完全逆转肾纤维化状态。

A假手术组 B模型组 C科素亚组 D黄芩素高剂量组 E黄芩素低剂量组

A假手术组 B模型组 C科素亚组 D黄芩素高剂量组 E黄芩素低剂量组

[1]Nan J-x,Park E J,YC K,et al.Scutellaria baicalensis inhibits liver fibrosis induced by bile duct ligation or Carbon tetrachloride in rats[J].J Pharm Phamlacol,2002,54(4):555-563.

[2]Inoue T,Jackson E K.Strong antiproliferative effects of baicalein in cultured rat hepatic stellate cells[J].European Journal of Pharmacology,1999,378(1):129-135.

[3]盛丽,姚岚,王莉,等.沙参水蛭黄芩人参对博莱霉素小鼠肺纤维化的影响[J].中医药学刊,2006,24(6)：1000-1002.

[4]谢红东,杨珂,穆焕德,等.黄芩提取物对大鼠肾间质纤维化的作用及其抗氧化机制[J].中国中西医结合肾病杂志,2009,10(3):240-242.

[5]Pirk E,Heldin C H,Ten-Dijke T P,et al.And regulation in TGF-β superfamily signaling[J].FASED Journal,1999,13(15):2105-2124.

[6]Sshiffer M,Von Gersdorff G,Bitzer M,et al.Smad proteins and transforming growth factor-beta signaling[J].Kidney International.Supplement,2000,77(77):45-52.