苏木乙酸乙酯提取物对大鼠心脏移植慢性排斥模型血清IL-4的影响

刘 颖，周亚滨

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院 心内二科，黑龙江 哈尔滨 150040)

白细胞介素4(IL-4)是由Th2分化出来的细胞因子,Th1和Th2均来自相同的Th细胞前体，在抗原递呈阶段，受环境和遗传因素的影响而分化成不同的细胞。在移植物的长期存活中，体内细胞因子的产生具有重要意义。为此本实验应用大鼠腹腔异位心脏移植模型，检测苏木乙酸乙酯提取物对大鼠心脏移植后血清中IL-4水平的影响,探讨苏木乙酸乙酯提取物在心脏移植后对机体的免疫抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年雄性，清洁级近交系大鼠，供者Wistar大鼠，体质量150～200 g；受者SD大鼠，体质量200～250 g。均购自黑龙江中医药大学附属第一医院实验动物中心。实验动物在通风、温度、湿度适宜的动物室内饲养。动物合格证号：2008001XYXK。

1.2 实验药物 环孢素A：将环孢素胶囊(华北制药集团新药研究开发有限责任公司，每粒含CsA 25 mg)溶于橄榄油中,稀释至3.5 mg/mL浓度，室温保存备用。苏木乙酸乙酯提取物:苏木，购自黑龙江省药材公司，产地云南，经生药鉴定。将苏木粗粉(40目)用75%乙醇浸泡4 h，加热至85 ℃，连续回流提取2 h，过滤；反复2次，将滤液合并，于旋转蒸发器中水浴蒸干，转入真空干燥箱中烘干至恒重，制成乙醇提取干粉。将乙醇提取干粉加入双蒸水混悬，用乙酸乙酯卒取，回收溶剂得到乙酸乙酯提取物。溶于橄榄油中，配制成含生药量0.115 g/mL，室温保存备用。

1.3 心脏移植慢性排斥动物模型建立 大鼠同种异位心脏移植术，采用改良的Ono术式,以Wistar大鼠为供体、SD大鼠为受体，术后将2 h清醒能站立,手指稍用力即可触及心脏跳动，且24 h内不停跳者作为实验动物模型，移植心脏存活时间以天为计算单位,手术当天按0天计算，不足24 h者采用四舍五入法计算，术后当天给予35 mg/(kg·d)CsA灌胃，并对大鼠进行编号,灌胃连续21 d，以抑制急性排斥反应。随机抽取存活的不同编号的大鼠3只，在光镜下观察移植物血管病理形态呈慢性排斥反应改变，为慢性排斥反应模型建立。

1.4 实验分组及给药 将连续灌服21 d CsA后成功存活的大鼠随机分为3组，每组8只。第1组为环孢素A组(环孢素组)，术后24 h环孢素A橄榄油灌胃，按35 mg/(kg·d)给药,连续给药21 d后，予环孢素A橄榄油灌胃，12 mg/(kg·d)给药，连续给药7 d至排斥终末。第2组为苏木乙酸乙醋提取物组(苏木组)，术后24 h环孢素A橄榄油灌胃，35 mg/(kg·d)给药，连续给药21 d后，予苏木乙酸乙醋提取物橄榄油灌胃，按含生药量1.15 g/(kg·d)给药,连续给药7 d至排斥终末。第3组为对照组，术后24 h环孢素A橄榄油灌胃，按35 mg/(kg·d)给药，连续给药21 d后，予等体积橄榄油灌胃，连续给药7 d至排斥终末。

1.5 标本的采集 术后28 d对大鼠行眼眶下静脉采血，离心，取血清，-80 ℃冰箱内冷藏，待做ELESA法检测。

2 结果

2.1 手术成功率 正式实验60例，成功29例，失败31例，其中血管吻合口出血过多致死20例；建立慢性排斥反应模型灌胃液体进入胸腔致死11例。成功率48.3%。

2.2 一般情况 术后大鼠多在2～4 h内清醒，呼吸平稳,心脏搏动规则、有力。4 h左右可以进食、饮水。3～4 d后刀口愈合。建立慢性排斥反应模型成功后，对照组一般情况及食欲较差，懒动，体毛疏松易脱落。环孢素组进食较少，皮毛无光泽。苏木组一般情况逐日好转，进食及活动量逐渐增加。

2.3 大鼠血清中IL-4的含量变化 见表1。

表1 各组大鼠血清IL-4水平的变化(±s)

3 讨论

Th0在不同细胞因子作用下可以分化为Th1、Th2等细胞亚群，进而分泌不同的细胞因子,在免疫应答中发挥重要作用。Thl/Th2具有不同的生物学功能、分泌不同的细胞因子。分别在细胞免疫和体液免疫中发挥作用。T细胞大部分效应功能是通过细胞因子来介导的。Thl分泌的细胞因子有IL-2、IFN-γ、TNF-α，以分泌IFN-γ为主，Ig表型为IgG2a；Th2分泌的细胞因子有IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13，以分泌IL-4为主,Ig表型为IgGl，IgE。

Thl参与CTL介导的细胞免疫；Th2促进抗体(IgGl与IgE)产生,参与体液免疫。同时Thl和Th2所分泌的细胞因子可相互作用:IFN-γ和IL-2可促进向Thl分化，并抑制Th2增殖；而IL-4、IL-10、IL-5、IL-6和IL-13可以促进向Th2分化,抑制Thl增殖和细胞免疫应答。在正常情况下，Thl和Th2功能处于动态平衡，当机体受到外来抗原攻击时，Thl和Th2中某一亚群功能增强，另一亚群功能减弱，该现象被称为“克隆转换”(clonaldiversion)。

接受器官移植的受者，当移植物发生排斥反应时，IFN-γ和IL-2等细胞因子表达增高；IL-4和IL-10等不表达或低表达[1]。研究[2]证明Thl与急性排斥反应有关；Th2与免疫耐受有关。移植免疫中通过细胞因子调节Thl/Th2分化及细胞因子表达有重要的临床意义。Thl能辅助CD8+CTL前体激活,使之增殖为效应性CD8+CTL；多种趋化性细胞因子可使活化的Thl迁移至移植物局部，发挥免疫学效应，从而引发急性排斥反应;而Th2主要介导体液免疫应答，辅助抗体生成，使抗原特异的B细胞分泌IgGl和IgE抗体,与免疫耐受的诱导和维持有密切关系。

Saggi等[3]在大鼠同种异体肾移植的模型中发现，在组织病理正常时IL-4、IL-10的局部表达增高，在排斥反应发生时IFN-γ表达才增高,因此认为，IL-4、IL-10的表达提示免疫耐受的产生,而IFN-γ的表达和IL-4的缺乏则提示急性排斥反应。He等[4]在大鼠心脏移植研究中发现，利用大鼠重组rIL-4对移植受体进行腹腔注射可以显著的延长移植物的存活时间。Shirwan等[5]在动物模型中发现长期存活的动物，血清IL-4和IL-10水平明显升高，而在急性排斥中二者的水平很低。

本实验结果表明，苏木乙酸乙酯提取物可明显升高大鼠血清IL-4水平,延长移植物的生存时间，减轻排斥反应，可在一定程度上说明苏木乙酸乙酯提取物具有一定的免疫抑制作用，是一种很有前途的心脏移植后免疫抑制剂。

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[5]Shirwan H,Barwari L,Khan NS.Predominant expression of T helper 2 cytokines and altered expression of T helper 1 cytokine in long-term allograft survival induced byintrathymic immune modulation with donor class I major histocompatibility complex peptides[J].Transpl,1998,66(12):1802-1809.