猪皮明胶肽体内抗氧化功效的研究

张 闽，董文宾, *，张小强，蔡 理

（1.陕西科技大学 生命科学与工程学院，陕西 西安 710021；2.陕西科技大学 化学与化工学院，陕西 西安 710021；3.空军工程大学 理学院，陕西 西安 710051）

1902年，伦敦大学医学院的Bayliss和Starling[1]第一次从狗的胃肠中分离到一种能引起胰腺分泌的活性多肽物质（促胰液素Secretin）以后，各国研究人员根据本国居民的膳食结构和蛋白质来源对活性肽进行了广泛的研究。目前，活性肽以其优于氨基酸的吸收方式及无可比拟的生理调节功能，已成为天然药物筛选和功能食品开发等领域研究的重点。因此，研究和开发肽类产品是20世纪以来生物技术领域中，人们极为关注且发展较为活跃的领域之一。

自由基氧化生物大分子变性引起机体结构和功能受损，从而诱导产生某些肿瘤、心脑血管疾病，引起疲劳、衰老，这些都已引起人们的强烈重视。抗氧化剂的消费量越来越大，生产量最大的化学抗氧化剂的毒副作用被逐步认识而受到限制，一些天然抗氧化剂也因为原料、价格、颜色等各种因素制约而发展有限[2]。因此低价、高效、低毒的天然食品抗氧化剂的开发成为研究热点。选用利用率或生物学效价不高的廉价农副产品及食品工业废水、废物为原料（如大豆粕、玉米黄粉、大米渣、鱼皮、鱼骨等）制备寡肽已成为当今工业一个热点[3-5]。各种原料生产的抗氧化肽以其分子量小、易吸收、活性强等特点受到重视，并能有效地清除体内过剩的活性氧自由基，保护细胞和线粒体的正常结构和功能，防止脂质过氧化的发生，在医药、化妆品、保健品、食品与饲料添加剂等方面有广阔的应用前景。因而筛选具有强抗氧化活性的天然资源已成为生物学、医学和食品科学研究的新趋势。我国是地大物博的国家，特别是在农产品资源方面，因此开发利用各种农产品生产高效的抗氧化剂具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食品级明胶（山东淄博杰乐宝恩生物科技有限公司馈赠），木瓜蛋白酶（Wolsen），KM封闭群无菌型小白鼠，雌雄各半（西安交通大学动物实验中心），微量丙二醛（MDA）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）试剂盒、总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒、总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒（南京建成生物工程研究所），其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机（德国Heraeus公司），MinimateTFFsystem型超滤机（英国PALL公司），PHS-3C型台式pH计（上海精密科学仪器有限公司），JJ-1型精密增力电动搅拌器（上海浦东物理光学仪器厂），722N紫外可见光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），其他为常规仪器。

1.3 方法

1.3.1 明胶肽的制备

参考相关文献[6-9]结合前期研究工作，用缓冲液在80℃溶胀明胶，木瓜蛋白酶水解明胶。酶解工艺条件：pH 6.2，酶含量4%，原料的质量浓度4%，水解温度51℃，时间5h。水解中用搅拌器3000r/min搅拌辅助酶解，水解完成后100℃加热25 min灭酶，水解液用高速冷冻离心机离心、过滤，澄清后超滤机筛选分子量低于5000u的上清液备用。

1.3.2 小白鼠分组饲养和运动训练

按照体重进行随机分组，共分成4个组，一个对照组和3个试验组。且每组要多养2～3只预防灌胃或者运动训练时溺水发生意外。日常自由采食饮水，灌胃饲养35d，灌胃时间安排在运动前2h，对照组灌胃双重蒸馏水，试验组给予水解明胶肽，饲养量为动物体重的3%。每天游泳训练一次，每次20min，水温（30±2）℃，不负重。

1.3.3 血清及组织匀浆的制备

血清的制备：运动后休息30min，用暖风机烘干小鼠，取血试管预先加入肝素抗凝剂（12500单位稀释30倍），并低温烘干。颈动脉无麻醉状态下取血，摇匀，即刻再放回冰浴中冷却，3000r/min离心10min，分离血清，然后将血清倾入另一洁净试管低温保存备用。

组织匀浆的制备：组织采样在采血后进行，将小鼠放在粗糙的平面上，左手向下按压颈椎，右手拉住小鼠尾部向后上方拉使颈椎脱臼处死小鼠（考虑化学麻醉导致组织留存较多血液，同时检测指标受化学试剂干扰影响测试结果，避免化学麻醉处死），在冰面上解剖后剥离取前（后）肢、肺和肝脏，经冰冻生理盐水漂洗后用滤纸吸干，加5%三氯乙酸沉淀蛋白，取适量湿组织加生理盐水按W:V=1:10在冰浴条件下用组织匀浆机制成匀浆（组织匀浆选小刀）。肺组织和肝脏控制转速3000r/min，时间为10min；肌肉控制转速为4000r/min，时间为15min，将上清液倾入另一洁净试管低温保存备用。

1.3.4 指标测定

按照试剂盒指定的方法测定微量丙二醛（MDA）含量、总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力、总抗氧化能力（T-AOC）和过氧化氢酶（CAT）活力。

2 结果与分析

2.1 明胶肽对小鼠体重的影响

小鼠购买后随机分组。对照组平均23.37g，方差0.91；实验1#组平均24.15g，方差0.93；2#组平均24.2g，方差0.86；3#组平均24.1g，方差0.89。灌胃饲养35d后，对照组平均30.8g，方差1.37；实验1#组平均31.2g，方差1.41；2#组平均31.5g，方差1.56；3#组平均31.3g，方差1.27。试验组小鼠体重和对照组比较无明显差异（p<0.05），说明明胶肽对小鼠体重无显著影响。

2.2 明胶肽体内抗氧化功效的测定结果与分析

表1 明胶肽对小鼠血液抗氧化酶活性和MDA 生成量的影响(n=10)Table 1 Effects of gelatin peptide on antioxidant enzyme activity and MDA production of mice's blood (n=10)

表2 明胶肽对小鼠不同组织抗氧化酶活性和MDA 生成量的影响(n=10)Table 2 Effects of gelatin peptide on antioxidant enzyme activity and MDA production of mice's organs (n=10)

生物体内存在消除自由基的防御系统，即由一些酶和非酶物质组成的抗氧化剂。包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）。SOD使超氧自由基被氧化成O2及同时还原成为H2O2；CAT可使过氧化氢分解成为水和氧气；GSH-PX可使还原型的谷胱甘肽转变为氧化型的谷胱甘肽，从而消除细胞中的有机或无机的过氧化物。非酶抗氧化剂有维生素E、维生素C、胡萝卜素、谷胱甘肽等，其可防止自由基的生成。这些抗氧化剂在体内构成一个完整的系统，分别对从氧化过程的开始到最后生成过氧化氢的自由基这一连锁反应的不同环节起作用，使体内自由基形成和消除处于一种动态平衡中。

尽管机体内有着各种抗氧化剂和抗氧化酶，但随着年龄的增长，体内抗氧化酶的活性逐步降低而氧自由基却有增无减，从而导致生理系统功能衰退，并诱发多种癌症及老年病。最近，国内外内许多研究表明，胶原水解所得到的胶原肽不但具有很好的消化特性，还有保护胃黏膜、抗溃疡、抗氧化、抗过敏、抗衰老、降血压、预防骨质疏松、促进伤口愈合、促进角膜上皮细胞的修复和生长、促进皮肤胶原代谢、免疫调节等许多独特的生理活性，已引起研究人员的广泛兴趣，胶原肽的很多活性都与其抗氧化性有关。从表1、表2可以看出，血清、肌肉、肺和肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）活力与正常对照组比较均增大，总抗氧化能力（T-AOC）也显示出一致的变化，体内各种抗氧化酶类在体内起到抑制自由基产生的作用。MDA是一种脂质过氧化产物，可直接反映机体的过氧化水平。实验结果显示，MDA生成量实验组明显比对照组低，以上数据均具有统计学差异性。表明明胶肽有着良好的体内活性，利用明胶肽灌胃小鼠具有提高生物抗氧化能力的功效，从而对机体起到保护作用。

依据已有的研究[10-12]，推测明胶肽发挥抗氧化活性与其氨基酸组成和肽分子构象有关。有许多抗氧化氨基酸在活性肽抗氧化过程中起到了重要作用，如亮氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸。脯氨酸或羟脯氨酸侧链和α-碳能够被自由基氧化，从而保护其他物质。而明胶肽中脯氨酸和羟脯氨酸含量在各种氨基酸含量中最高，推测明胶肽的这种氨基酸组成是其具有抗氧化作用的重要原因，此外，许多肽比构成其的氨基酸抗氧化性要强，所以保持一定的肽链构象同样对活性肽的抗氧化活性有着很重要的作用。其作用机理还可能与其易吸收特性、高相融有关。

3 结论

大量的研究显示[13-14]，生物体各器官均会产生不同程度的自由基，而同时也存在消除自由基的防御系统。正常情况下，自由基与自由基防御系统处于动态平衡中，一旦平衡被打破，自由基造成对机体的毒性作用。就会产生各种疾病，特别是一些慢性病如肿瘤、糖尿病、高血压等，从而影响人体的健康。猪皮明胶酶解物可以有效地降低小鼠血清、肝组织、肺组织和肌肉组织中MDA的含量，提高小鼠血清、肝组织、肺和肌肉组织中的T-SOD、GSH-PX、CAT的活力和T-AOC。各项指标与对照组相比有极显著差异，可以说明猪皮明胶肽具有一定的抗氧化性。

猪皮是猪肉生产过程中的一种副产品，在肉制品厂的猪肉加工过程中，猪皮经过热处理后不能用于皮革制作，而在生肉的零售过程中，剔掉的碎猪皮亦无法用于皮革制作，除了部分食用外，其他的应用较少。猪皮的主要成分为蛋白质、脂肪、水，还有少量的纤维素和矿物质。猪皮蛋白质主要是胶原，胶原由于特殊复杂的空间结构，其分子量高达300ku，很难被机体消化吸收，通过蛋白酶水解可以将猪皮中的蛋白质水解为肽，其反应温和，产品安全，适用于功能食品、化妆品及其他健康相关产品。本文主要以正常小鼠作对照，用自己制备的明胶肽喂养小鼠，各组自由饮水，自由摄食，饲喂35d后，禁食，颈动脉采血，并解剖取肝、肺和肌肉组织测定微量丙二醛（MDA）含量，总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、过氧化氢酶（CAT）活性和总抗氧化能力（T-AOC）来研究明胶肽的体内抗氧化作用，以期为开发新的活性肽药物和活性成分提供理论依据。

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