产低温脂肪酶菌株的筛选、纯化及其部分酶学性质研究

王春雨，迟乃玉*，张庆芳

（大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622）

低温脂肪酶具有高效、耐热、作用周期短等优势，在应用上具有中高温脂肪酶无法取代的优越性，因此低温脂肪酶广泛的应用在食品、轻纺、皮革、香料、化妆品、洗涤剂、有机合成、医药等领域上。国外研究者对其中几种典型的脂肪酶如来源于Candida rugosa[6]、Candida antarcticaA[7]、CandidaantarcticaB[8]、Rhizomucor miechei[9]、Thermomyces lanuginosus[10]的脂肪酶的应用进行了详细的综述，这些脂肪酶在油脂加工和食品工业、寿星药物合成、生物能源、医药和化妆品等行业显示出良好的前景。相比于国外，国内目前只有作为洗涤剂的碱性脂肪酶，而酯化或转酯化用的脂肪酶还是空白。

本文从大连大黑山和渤海湾采样，筛选产低温脂肪酶的菌株，并对其产酶条件进行研究。

1 材料与方法

1.1 土样来源

渤海湾海水和大连大黑山土样。

1.2 培养基

Luria-Bertani（LB）培养基[11]：胰蛋白胨1.0%，酵母提取物0.5%，NaCl 1.0%，琼脂1.5%，pH7.0。

初筛培养基：蛋白胨1.0%，酵母粉0.5%，NaCl 0.5%，CaCl20.02%，Tween80 1.0%，pH7.2。

发酵培养基：酵母膏0.5%，（NH4）2SO40.5%，KH2PO40.2%，NaCl 0.3%，MgSO4·7H2O 0.05%，橄榄油2%（v/v），pH7.0。

在教学中，建立关系的前提是师生之间发生交流和交往，但现在的许多课堂，只是单向的教师讲授、学生接收。教师的注意力主要在“教”，没有注意到在“教”的过程中与学生发生交流和交往，建立某种超越客观知识的情感关系。我试图强调的是，在“教”的过程“之中”发生了什么。当前，我们没有很好地区别什么是教师关注自己的教学本身，什么是关注教学“之中”发生的事情。这个区别不是特别明显，但同时这个区别又是巨大的。

牛肉膏蛋白冻培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，Na-Cl 0.5%，琼脂1.8%，pH7.0。

1.3 产低温脂肪酶菌株的初筛

样品稀释至10-7后，接种于初筛培养基平板上，20℃培养4d。产脂肪酶的菌株能分解Tween80在菌落周围形成白色沉淀圈。将产生白色沉淀圈的菌株活化后，分别接种于初筛培养基平板上，记录菌落直径与沉淀圈直径之比。

1.4 产低温脂肪酶菌株的复筛

将待测菌株活化后，接种于种子液中，20℃、160r/min培养12h，转接于100mL发酵液中，20℃、160r/min培养2d，测其酶活。

1.5 产低温脂肪酶菌株的紫外诱变

选出一株菌落直径与沉淀圈直径之比和酶活最大的菌株，将其制成种子液，在20℃、160r/min培养12h。把菌液稀释到适当梯度，置于磁力搅拌器上，在紫外灯的功率15W，照射的距离为30cm的条件下，照射不同时间进行紫外诱变。分别吸取不同照射时间的稀释液均匀涂布到初筛培养基上，装入黑布袋中，倒置于恒温箱中，在20℃培养3d，取出计算菌落数，并观察白色沉淀圈。

1.6 脂肪酶活性测定方法

取3mL 50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH值为7.0）和1mL橄榄油，放入水浴恒温磁力搅拌37℃中预热5min，加入0.1mL酶溶液，磁力搅拌10min，立即加入8mL笨，继续搅拌2min，终止反应，同时萃取生成的脂肪酸。将溶液转移至离心管中，4000r/min离心10min，有机相和水相分离澄清。取上层有机相4mL于小锥形瓶中，加入1mL显色剂，磁力搅拌上搅拌3min，4000r/min离心10min，取上层含有脂肪酸铜的苯溶液，用分光光度计在波长710nm处测OD值。

由脂肪酶活力定义得活力计算公式：脂肪酶活力（单位/mL）=CV/TV’，公式中C脂肪酶的浓度（μmol/mL）；V脂肪酸/苯溶液的体积（mL）；T作用时间（min）；V’酶液的用量（mL）。

1.7 产脂肪酶菌株的鉴定

1.7.1 形态学、生理生化特征

产脂肪酶菌株的形态学观察、生理生化实验参照文献[12]方法进行。

1.7.2 16SrDNA序列测定和分析

以菌株CZWOO1总DNA为模板，利用真细菌的16SrDNA通用引物进行PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳分析，得到一条1.5bp左右的条带（见图1）。以Seq Forward、Seq Internal和16SSeqF1为引物进行DNA测序。序列分析结果表明，菌株CZWOO1的16SrDNA序列得到有效扩增，其大小为1429bp。进入NCBI主页，应用BLAST程序与数据库中的已有细菌16S rDNA序列进行相似性比较分析。利用ClustalX1.83进行匹配比对，然后用MEGA5.05软件构建系统发育树。

图1 3%琼脂糖凝胶电泳Fig.1 3% Agarose gel electrophoresis

2 结果

2.1 菌种筛选

从59株来自大连大黑山土样和渤海湾海水的细菌中筛选到10株产低温脂肪酶的菌株，其中以菌株007的直径比最大且酶活最高，其酶作用温度最低（25℃）。对该菌株进行紫外诱变，当诱变130s时，致死率达到90.7%，得到一株直径比和酶活明显高于原菌株的菌株，命名为CZWOO1。

2.2 菌种鉴定

2.2.1 形态学、生理生化特征

菌株CZWOO1在LB培养上20℃培养3d，菌落乳白色、圆形、隆起、不透明、表面光滑、湿润、边缘整齐，直径约0.9cm。菌体革兰氏阴性、短杆状。常规生理生化特征见表1。

2.2.2 分子生物学鉴定

序列分析结果表明，菌株CZWOO1的16SrDNA序列全长为1429bp。将序列输入GenBank进行BLAST相似度比较，下载相似度序列，利用ClustalX进行多序列匹配比对，通过MEGA5.05软件计算出序列的系统进化距离，采用Neighbor-Joining构建系统进化树（见图2）。菌株CZWOO1与Bacillusthuringiensis（NR 043403.1）亲缘关系最近，同源性达到100%，因此菌株CZWOO1属于芽孢杆菌属中的苏云金芽孢杆菌，命名为BacillusthuringiensisCZWOO1。

2.3 脂肪酶的分离纯化及二级结构预测

表1 菌株CZWOO1 生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the strain CZWOO1

图2 菌株CZWOO1基因系统发育进化树Fig.2 Phylogenetic trees for 16S rDNA sequence of CZWOO1

苏云金芽孢杆菌CZW001脂肪酶发酵上清经65%硫酸铵沉淀，用0.05mol/LTis-Hcl缓冲液（pH8.2）溶解，并用相同的缓冲液4℃透析12h获得粗酶液。经截留分子量为10ku的中空纤维柱超滤浓缩，将浓缩液加到预先用Tis-Hcl缓冲液（0.05mol/L pH8.2）平衡好的DEAE-纤维素-52层析柱（Φ1.6×30cm）上，用250mL 0～1mol/L的NaCl线性梯度洗脱。利用平板定性检测脂肪酶活性，收集含脂肪酶各管，测定其酶活，合并含酶活各管。将样品过Sephadex G-100（Φ1.6×50cm）柱，用0.05mol/L Tis-Hcl缓冲液（pH8.2）洗脱，收集有酶活性部分，结果见图3。蛋白曲线呈现一个小峰和一个大峰，而低温脂肪酶酶组分主要集中在大峰内，25管～45管范围内的蛋白峰酶活性比较高，说明Sephadex G-100凝胶柱已经除去了一部分高分子量和低分子量的蛋白，将目的酶蛋白同其他杂蛋白分离开来。

苏云金芽孢杆菌CZW001脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、超滤离心、DEAE-纤维素-52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析等纯化步骤，脂肪酶纯化倍数为75.5倍，活性回收率为37.6%。其中DEAE-纤维素-52离子交换层析效果最佳，仅此一步就纯化了56倍（纯化效果见表2）。SDS-PAGE凝胶电泳[9]显示纯化后的脂肪酶为单一条带（见图4），分子量约为40ku。纯化倍数为75.5倍，活性回收率为37.6%，跑12%SDS-PAGE电泳为单一条带（见图4），分子量约为40ku。

对多次分离纯化的低温脂肪酶进行圆二色谱分析，见图5。用Jascow32软件分析及Yang-chen公式计算其二级结构成分：α-螺旋10.6%，β-折叠40.1%，β-转角18.8%，无规则卷曲30.5%。

图3 Sephadex G-100 凝胶过滤Fig.3 Gel filtration chromatogram of Sephadex G-100

表2 脂肪酶的纯化Table 2 Purification of Bacillus thuringiensis CZWOO1 lipase

图4 12%SDS-PAGE电泳图Fig.4 12% SDS-PAGE of enzyme solution

图5 低温脂肪酶圆二色谱图Fig.5 The CD spectrum of cold-active amylase

2.4 脂肪酶性质

2.4.1 pH值对CZWOO1脂肪酶活力的影响

在30℃、不同pH值条件测定菌株CZWOO1脂肪酶活力，结果见图6。该酶的适宜作用pH值范围在7～9，最适pH值为8。

图6 p H值对CZWOO1脂肪酶活力的影响Fig.6 Effects of pH value on lipase activity of CZWOO1

2.4.2 温度对CZWOO1脂肪酶活力的影响

图7 温度对CZWOO1脂肪酶活力的影响Fig.7 Effects of temperature on lipase activity of CZWOO1

在pH8.0条件下，测定10℃～45℃温度范围酶活力与温度的关系，结果见图7。CZWOO1脂肪酶活力在25℃达到最高，在10℃是仍具有较高的酶活，相对酶活达到38%。

2.4.3 温度对CZWOO1脂肪酶稳定性的影响

将酶液在不同温度中保温30min，在25℃、pH8.0条件下，测定CZWOO1脂肪酶残余活力。结果见图8，CZWOO1脂肪酶稳定性较差，在60℃处理30min，酶活损失达70%。

图8 温度对CZWOO1脂肪酶稳定性的影响Fig.8 Effects of temperature on lipase stability of CZWOO1

3 讨论

菌株CZWOO1为革兰氏阴性短杆菌，兼性厌氧，不能水解淀粉、明胶、纤维素和尿素，能水解油脂，使阿拉伯糖、木糖和甘露糖产酸，吲哚和柠檬酸盐试验阴性。从菌株CZWOO1基因系统发育进化树看，菌株CZWOO1与Bacillus thuringiensis（NR 043403.1）亲缘关系最近，同源性达到100%，因此菌株CZWOO1属于芽孢杆菌属中的苏云金芽孢杆菌，命名为BacillusthuringiensisCZWOO1。

苏云金芽孢杆菌CZW001脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、超滤离心、DEAE-纤维素-52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析得到电泳纯的脂肪酶，跑12%SDS-PAGE电泳为单一条带，分子量约为40ku。对纯化后的低温脂肪酶进行圆二色谱分析，结果表明，其二级结构成分：α-螺旋10.6%，β-折叠40.1%，β-转角18.8%，无规则卷曲30.5%。对该脂肪酶二级结构的预测给其适冷机制的研究奠定基础。

对BacillusthuringiensisCZW001分泌的脂肪酶的初步研究表明，该脂肪酶的适宜作用pH值范围在7～9，最适pH值为8，最适作用温度为25℃，对热敏感，60℃处理30min仅残留30%酶活性。该低温脂肪酶在低温下具有良好的催化活性，作用pH值偏碱性（pH7～9）等特点，应在环境治理、洗涤业等领域有着良好的应用前景，并且其对热敏感等特点，从而避免高温灭活对食品品质产生的破坏，在食品工业也有良好的应用潜力。

[1]QU YEN D T,SCHMIDT-DANNERT C,SCHMID RD.High-level expression of alipasefromBacillusthermocatenulatusBT L2 inPichia pastorisand some properties of the recombinant lipase[J].Prot Expr Pur,2003,28(1):102-110.

[2]林学政，边 际，何培青.极地微生物低温适应性的分子机制[J].极地研究，2003，15（1）：75-82.

[3]RASHID N,SHIMADA Y,EZAKIS,et al.Low-temperature lipase from psychrotrophicPseudomonassp strain KB700A[J].Appl Environ Microb,2001,67(9):4064-4069.

[4]LEEHK,AHNMJ,KWAK SH,et al.Purification and characterization of cold active lipase from psychrotrophicAeromonassp.LPB 4[J].J Microbiol,2003,41(1):22-27.

[5]TRIPATHIM K,ROY U,JINWAL U K,et al.Cloning,sequencing and structural features of a novelStreptococcuslipase[J].Enzyme Microb Technol,2004,34(5):437-445.

[6]BENJAMIN S,PANDEY A.Candida rugosalipases:molecular biology and versatility in biotechnology[J].Yeast,1998,14:1069-1087.

[7]DOMINGUEZ DE M P,CARBONI-OERLEMANS C,TUIN B,et al.Biotechnological applications ofCandida antarcticalipase A:stateof the art[J].J Mol Catal B:Enzym,2005,37:36-46.

[8]ANDERSON E M,LAARSSON K M,KIRK O.One biocatalyst many applications:theuseofCandidaB-lipaseinorganic synthesis[J].Biocatal Biotransf,1998,16:181-204.

[9]RODRIGUE S R C,FERNANDEZ-LAFUENTE R.Lipase fromRhizomucor mieheias an industrial biocatalyst in chemical process[J].J Mol Catal B:Enzyme,2010.

[10]FERNANDEZ-LAFUENTER.Lipase fromThermomyces lanuginosus:usesand prospectasan industrial biocatalyst[J].J Mol Catal B:Enzym,2009,62(3):197-212.

[11]SAMBROOK J,FRISH E F,MANIATIS T.Molecular.Molecular Cloning：Alaboratory Manual[M].Second Edition.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

[12]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.