高盐稀态酱油发酵S3-2酵母基础发酵性能的研究

卫永华，于雁飞，王春玲，罗依青，侯丽华*

（1.天津科技大学教育部食品营养与安全重点实验室，天津 300457；2.山东永康食品有限公司，山东 烟台 264006）

酿造酱油是以大豆和小麦为原料，利用微生物分泌的各种酶将植物蛋白质及碳水化合物水解、发酵形成的具有独特色、香、味、体的液体调味品[1]。S酵母又称鲁氏酵母，是最常见的耐高渗酵母，在酱油酿造过程中，S酵母能够形成乙醇、高级醇、酯类、糠醛、琥珀酸和4-羟基-呋喃酮类等物质[2-3]，对酱油风味的形成起到重要的作用。但是在高盐稀态酱油的实际生产中，酱醪的含盐量通常高于18%，这极大的影响了S酵母的生存状态和发酵活力，使其不能发挥应有的作用。因此S酵母的耐盐能力是利用其改善酱油风味的一个“瓶颈”。

S3-2酵母是本实验室以S酵母为出发菌株，利用基因组重组技术构建的一株具有高耐盐度的新型酵母菌株[4]。以S酵母为对照菌株，对S3-2耐盐能力和香气成分产生能力进行比较研究，将可以为S3-2酵母在高盐稀态酱油发酵中的应用提供一定的理论基础，对促进S3-2酵母在实际生产中的应用也具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 菌种

S酵母由天津科技大学菌种保藏中心提供；S3-2酵母是本试验室以S酵母为出发菌株，经过基因组重组技术构建的新型耐盐酵母。

1.2 试验试剂

本实验中所用试剂均为分析纯。

1.3 仪器与设备

QP2010SE气相色谱质谱联用仪：日本岛津有限公司。

1.4 培养基

YPD培养基[5]：酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g溶于1000mL蒸馏水中，121℃灭菌15min。固体培养基需另添加15g～20g琼脂粉。

YPDN培养基：在YPD培养基的基础上，按试验需要加入不同质量的NaCl，121℃灭菌15min。

YPD发酵培养基：称取酵母粉10g、蛋白胨20g、NaCl 180g和葡萄糖60g溶于1000mL水中，115℃、15min灭菌。

1.5 试验方法

1.5.1 S3-2酵母和S酵母的活化

从S3-2和S酵母的斜面培养基上各挑取一环酵母，接入YPD液体培养基中，于30℃、150r/min过夜活化培养。

1.5.2 S3-2酵母和S酵母耐盐能力的比较

取适量活化好的酵母菌液转接至含盐量分别为18%、19%、20%和21%的50 mL YPDN液体培养基中，使菌液初始浓度达到5×106个/mL，并置于30℃、150r/min条件下振荡培养。自接种（零时）算起，每隔12h在无菌室取样，测定OD600，并绘制S3-2酵母和S酵母生长曲线。

1.5.3 S3-2酵母和S酵母基础发酵性能比较研究

将活化好的S3-2酵母和S酵母依次转接于含盐量为12%和16%的YPDN液体培养基中，扩大培养至对数后期。将扩大培养的酵母转接于装有500mL YPD发酵培养基的厌氧瓶中，并置于30℃静置发酵。每2d测定一次还原糖含量、乙醇含量和风味物质。全体样品分为S酵母组和S3-2酵母组，每组样品设3个平行样品。

1.5.4 还原糖含量的测定[6-7]

采用菲林试剂容量法进行还原糖含量的测定。

1.5.5 乙醇含量[7-8]

采用蒸馏法法测定。

1.5.6 香气成分的测定

样品前处理[9]：本试验利用顶空固相微萃取法（SPME）对发酵液中的香气成分进行提取[10]。首先将聚二甲基硅氧烷（PDMS）固相微萃取头在气相色谱的进样口老化至无杂峰，老化温度250℃，时间50min。取5g发酵液样品于15mL干净的萃取瓶中，在45℃水浴平衡30min，再将老化结束的PDMS萃取头插入瓶中。萃取头与样品液面应保持一定距离，避免萃取头表面沾水。萃取温度45℃，萃取时间30min。

色谱条件[11]：VF-5MS毛细管色谱柱（30mm×0.25mm×0.25mm），载气：氦气（纯度99.999%），流量1mL/min，分流比5:1。PDMS萃取头插入进样孔，250℃解吸5min。

程序升温：起始温度40℃，保持30min，以4℃/min的速度升至150℃，保持1min，再以8℃/min的速度升至250℃，保持6min。

质谱条件：接口温度280℃，离子源温度220℃，溶剂延迟时间1.5min，电子能量70eV，扫描质量范围43u～500u。

数据分析：数据收集用HP化学工作站软件对照NIST05库进行，成分先由谱库初步鉴定，结合化学成分的保留时间、质谱、实际成分、保留指数并参考相关文献[12-13]进行定性。定量采用面积归一化法相对定量。

2 结果与分析

2.1 S3-2酵母和S酵母耐盐能力的确定

取活化好S3-2酵母和S酵母菌液转接至含盐量分别为18%、19%、20%和21%的YPDN液体培养基中，30℃、150r/min条件下振荡培养，其生长状况见图1和图2。

图1 酵母S在高盐YPDN培养基中的生长情况Fig.1 The growth of yeast S grown in YPDN medium with high concentration salt

由图1和图2可以看出，相同接种量的S3-2酵母和S酵母在不同盐度条件下表现出不同的生长状态。S3-2酵母在含盐量达21%的培养基中仍能够良好生长，但S酵母能生长的最大盐度只有19%。且在19%的YPDN培养基中，S酵母进入对数期的时间比S3-2酵母推迟了将近24h；在18%盐度培养基中，S酵母平稳期菌体浓度也低于S3-2在平稳期的菌体浓度。表明S3-2酵母比S酵母具有更高的耐盐能力，其在高盐环境中能更好地进行生存和代谢活动。

图2 S3-2酵母在高盐YPD培养基中的生长情况Fig.2 The growth of yeast S3-2 grown in YPD medium with high concentration salt

2.2 S3-2酵母和S酵母基础发酵性能研究

酵母在酱醪的后期发酵中是一个以还原糖为碳源，进行厌氧代谢，产生醇类等风味物质的过程。YPD培养基含有丰富的碳源和氮源，与酱醪相比，其组分简单，干扰少，有利于在短期内对S3-2酵母和S酵母的基础发酵特性进行研究。同时，为了使YPD发酵培养基中的还原糖含量与酱醪接近，本研究将培养基中葡萄糖含量提高至6%。

2.2.1 S3-2酵母和S酵母的还原糖消耗能力和产乙醇能力比较

为了分别对S3-2酵母和S酵母的还原糖消耗能力和乙醇产生能力进行比较研究，本研究定时对接入2株酵母的YPD发酵培养基进行还原糖和乙醇含量测定，结果见图3。

图3 发酵培养基中葡萄糖和乙醇含量变化Fig.3 The changes of glucose and ethanol in the fermentation medium

图3表明，在前2d内，由于S酵母菌体对高盐环境需要一个适应过程，所以生长代谢不旺盛，还原糖的消耗和乙醇含量的增加都较为平缓。而S3-2酵母适应高盐环境能力较强，在发酵第2d，乙醇的生成和还原糖的消耗反应已经以较快的速率进行。随着发酵时间的延长，S和S3-2代谢速度加快，还原糖的消耗和乙醇的形成都有较快速的增加，但是S3-2酵母的还原糖消耗和乙醇产生速率要明显高于S酵母。在发酵进行10d之后，由于还原糖被消耗殆尽和菌体的死亡，S3-2和S酵母产乙醇速率趋于平缓。综上所述，在高盐培养基中，S3-2酵母的还原糖消耗能力和乙醇产生能力要高于S酵母。乙醇具有清爽的香气，是酱油的基础物质。同时乙醇还可通过氧化和酯化反应生成有机酸和酯类物质，S3-2酵母较高的乙醇产生能力对促进酱油香气形成是十分必要的。

2.2.2 S3-2酵母和S酵母产生香气成分能力的比较

为了研究S3-2酵母和S酵母在高盐环境中产生的香气成分的特点，本研究对其在含盐量为18%的YPD发酵培养基中的香气成分进行GC-MS测定，结果见表1～表4。

从表1～表4可以知道，利用SPME-GC-MS方法检测出来的风味物质包括酸类、醇类、酯类、酚类、醛类、醚类和酮类等化合物。本研究在S3-2酵母和S酵母发酵过程中检出的风味物质分别有43种和41种，表明S3-2酵母在高盐环境中可利用YPDN发酵培养基比S酵母产生较多的风味物质。酵母在不同的发酵时期产生风味物质种类和含量有着显著地差异。

醇类是发酵体系中最重要的风味物质。随着发酵的进行，其种类和含量一直处于上升状态。在发酵结束时，与S酵母相比，S3-2酵母产生的醇类物质种类增加2种，含量提高4.89%。用PDMS固相微萃取纤维头吸附的醇类多为高级醇，其中苯乙醇是酱油中关键的挥发性风味物质[14]，其除在添加S酵母的0d发酵培养基中未被检出外，在其他样品中一直以较高含量存在。苯乙醇具有清甜的玫瑰样花香，对酱油风味贡献较大[15-16]。苯乙醇既能被氧化为苯乙醛和苯乙酸，又可与醇形成缩醛，还可与酸类物质形成苯乙酯类化合物，所以在后期相对含量减少。新戊醇有薄荷油味，在发酵的全部过程中都一直能检测到；1-壬醇具有类似桔子和甜橙的气息；十一醇具有玫瑰花香和柑橘、菠萝的果香。这3种醇虽然相对含量不大，但在发酵过程中一直存在，可能也是S3-2酵母和S发酵产生的特征性风味。1，9-壬二醇仅在S酵母发酵到第6d时检出，且不存在于S3-2酵母发酵体系中。3-呋喃甲醇具有刺激性，但随着发酵的进行含量降低。

酯类物质的种类和相对含量随着发酵的进行也呈现增加的趋势。但表3、表4的结果表明，S3-2酵母产生的酯类物质种类和含量略低于S酵母。乙酸乙酯具有水果香气，其是由酒精发酵阶段的主产物——乙醇与乙酸酯化而成，随发酵的进行含量升高。乙酸异戊酯具有较强的新鲜果香，稍甜，是苹果、香蕉的主要香气成分之一，主要由乙酸和异戊醇酯化生成。癸酸乙酯有葡萄酒香气；丁酸苯乙酯呈蜂蜜的甜香味；十四酸乙酯呈椰子的香味；十六酸乙酯呈微弱奶油香气。以上这几种酯类化合物都可通过有机酸与乙醇的酯化反应生成。其在2株酵母的发酵体系中一直存在，但相对含量都不高，可能与发酵周期短，酯化反应进行不完全有关。

表1 S 酵母在发酵过程中产生的香气成分的变化Table 1 The changes of aroma components of YPDN fermentation medium adding S yeast

表2 S3-2 酵母在发酵过程中产生的香气成分的变化Table 2 The changes of aroma component of YPDN fermentation medium adding S3-2 yeast

表3 S 酵母在YPD 培养基中发酵产生的香气成分的含量和种类变化Table 3 Changes of relative contents of different classes of aroma components in YPDN fermentation medium adding yeast S

表4 S3-2 酵母在YPD 培养基中发酵产生的香气成分的含量和种类变化Table 4 Changes of relative contents of different classes of aroma components in YPD fermentation medium adding yeast S3-2

辛酸乙酯有类似白兰地的香气，并有甜味；棕榈酸乙酯呈微弱蜡香和奶油香气；癸酸乙酯带花生香气的油状液体。这3种乙酯类化合物也是一些酒类饮料的主要风味成分，仅在S3-2酵母发酵体系被检出。

本部分检出的有机酸主要有丁酸、异戊酸、2-甲基丁酸和苯乙酸。其中，丁酸用作香味剂时，使用极微量时就能发出很强、很浓的气味。其还参与酯化反应生成有愉快水果香味的丁酸乙酯和有雪梨香味丁酸异戊酯；苯乙酸广泛存在于葡萄、草莓、可可、绿茶、蜂蜜等中。苯乙酸可能主要是由苯乙醇氧化而来。在低浓度时具有甜蜂蜜味，并且具有很强的杀菌作用。这4种物质在2个发酵体系中的含量相差不大。

本研究中被检测的羰基类化合物种类和含量都比较少，主要的有乙二醇甲醚、异戊醚和2，4-二叔丁基苯酚，其在2个发酵体系中均被检出。其中需要注意的是乙二醇甲醚和异戊醚具有一定的毒性，在发酵过程中应尽量避免其的生成。2，4-二叔丁基苯酚属医药中间体和材料中间体，但在本试验中大多呈跳跃性走低的趋势。吡嗪类化合物主要有2-乙基-3-甲基吡嗪（具有加热牛肉时发出的香味）和2，6-二甲基-吡嗪（呈刺鼻的炒花生香气），其主要在发酵前期产生，随着发酵的进行，含量越来越低。这充分说明在复杂的生物发酵过程中，许多物质会处于不断的分解与合成中。

3 结论

综上所述，S3-2酵母比S酵母具有更高的耐盐能力。在含盐量为18%的YPD发酵培养基中，具有更高的高级醇类物质产生能力。结合S3-2酵母较高的乙醇产生能力，可以初步判断其为醇香型酵母。丰富的醇类物质不但能增加酱油的醇香，还可以为酱油后期的酯化反应提供充足的原料，因此，S3-2酵母的应用将对酱油风味的提高有着重要的意义。

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