NaOH-过氧乙酸预处理白酒丢糟多酶复配糖化研究

陈 喆 ，杨 健，钟 霞，张 健,2，吴正云，张文学,3 *，伍学明,4，徐 义，杨 莉

（1.四川大学 轻纺与食品学院，四川 成都 610065；2.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川 宜宾 644005；3.四川大学 锦江学院白酒学院，四川 眉山 620860；4.四川省调味品添加剂工程技术研究中心，四川 眉山 620010）

白酒丢糟是固态法生产白酒的主要副产物[1]，粗略推算我国年产白酒丢糟达2400万t。大量丢糟如果不及时处理，就会腐败变质，不仅浪费宝贵资源，还会严重污染环境[2-3]。白酒丢糟富含淀粉、纤维素和半纤维素等碳水化合物，据估计，如果利用白酒丢糟生产燃料酒精，白酒行业每年可增加产值90亿元～150亿元[4]。

由于白酒丢糟结构复杂很难被降解，为提高酶水解效率首先要进行预处理。ZHAOX B等[5]用纤维素酶和β-葡萄糖苷酶糖化经NaOH-过氧乙酸预处理的甘蔗渣，证明NaOH-过氧乙酸预处理是较合适的预处理方法。与其他预处理方法相比，NaOH-过氧乙酸预处理条件温和、工艺简单，且能将物料中的纤维素、半纤维素和木质素有效分离，产生较少抑制物[6-7]。

纤维素酶的主要组分是葡萄糖内切酶、葡萄糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。只有当这3个主要组分的活性比例适当时，才能协同完成对纤维素的高效降解[8-9]。如果再添加β-葡萄糖苷酶，会显著提高纤维素酶糖化效率[10-11]。而完全降解半纤维素需要半纤维素酶和木聚糖水解酶系协同完成[12]。半纤维素被木聚糖酶水解后，可降低物料对纤维素酶的无效吸附，提高单糖产率。且阿拉伯糖酶、果胶酶及淀粉酶等酶能有效降解阿拉伯糖、果胶及淀粉等多糖，提高酶水解液可发酵糖浓度。ZHOU J等[13]将7种纯化酶用于糖化经蒸汽爆破预处理的玉米秸秆，所得水解液葡萄糖含量15.5g/L，是单用纤维素酶糖化的2.1倍。TABKA MG等[14-18]也对多酶复配做了大量的研究。

目前，国内外对生物质材料生产燃料酒精的研究多集中在不同预处理方法对单酶糖化效果的影响上，而对多酶复配糖化效果的研究少见报道。在本研究中，以NaOH-过氧乙酸预处理的白酒丢糟为原料，探讨了6种酶复配糖化的工艺，为进一步利用生物质材料降解糖制备燃料酒精、食用酒精、食用冰醋酸以及焦糖色的工艺提供了重要参考。

1 材料与方法

1.1 材料

白酒鲜丢糟（水分含量65%，冷冻保存，使用前置于105℃烘箱干燥12h）四川水井坊股份有限公司，水分6.49%、灰分12.61%、热水抽提物12.63%、1%NaOH抽提物21.24%、苯-乙醇抽提物7.74%、酸溶性木素5.84%、综纤维素60.05%、纤维素32.03%、半纤维素19.21%、木质素18.61%；

纤维素酶NS22086（FPU酶活为25.47IU/mL）、β-葡萄糖苷酶NS22118（酶活为15.12IU/mL）、木聚糖酶NS22083（酶活为17.08IU/mL）、葡糖淀粉酶NS22035（酶活为11.54IU/mL）、复合酶NS22119（其中主要的β-葡萄糖苷酶酶活为6.77IU/mL）和复合酶NS22002（其中主要的β-葡萄糖苷酶酶活为3.63IU/mL，木聚糖酶酶活为3.14IU/mL）诺维信天津分公司；

葡萄糖试剂盒：长春汇力生物技术有限公司；木糖、间苯三酚、氢氧化钠、过氧乙酸等均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 NaOH-过氧乙酸预处理

将100g白酒干丢糟和2%NaOH以固液比1:10（w:v）混合均匀，于85℃水浴90min，滤渣用温水洗至中性，于60℃烘至恒重，称重；再将100g处理过丢糟和6%过氧乙酸以固液比1:5（w:v）混合均匀，于75℃处理90min，滤渣用温水洗至中性，于60℃烘至恒重备用。

1.2.2 白酒丢糟酶解的单因素试验

采用经预处理后干燥的白酒丢糟为底物，对酶解底物浓度及6种酶（以纤维素酶NS22086为主，补充β-葡萄糖苷酶NS22118、木聚糖酶NS22083、复合酶NS22119、复合酶NS22002和葡糖淀粉酶NS22035）添加量分别采用单因素试验法进行探讨。其中复合酶NS22119包括β-葡萄糖苷酶、阿拉伯糖酶、木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和木糖酶；复合酶NS22002主要包括木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，附加纤维素酶、半纤维素酶和己糖酶。

在试验中，用柠檬酸缓冲液（pH4.8～5.0）调节底物浓度，添加2%叠氮化钠1mL，于50℃、120r/min的摇床糖化48h，离心得上清液。将上清液稀释一定倍数后，测定酶解液总糖、葡萄糖和木糖浓度及产率，并以此作为实验结果评价指标，确定各种酶对多酶糖化过程的贡献程度。试验结果的差异显著性分析采用F检验。

1.2.3 添加不同酶酶解白酒丢糟试验

采用经预处理后干燥的白酒丢糟为底物，添加柠檬酸缓冲液（pH4.8～5.0）调节底物浓度14%（w/v），在添加1mL 2%叠氮化钠的基础上，分别添加A-0.20mL/g NS22086；B-0.20mL/g NS22086和0.10mL/g NS22118；C-0.20mL/g NS22086、0.10mL/g NS22118和0.02mL/g NS22083；D-0.20mL/g NS22086、0.10mL/g NS22118、0.02mL/g NS22083和 0.04mL/g NS22119；E-0.20mL/g NS22086、0.10mL/g NS22118、0.02mL/g NS22083、0.04mL/g NS22119 和0.04mL/gNS22002；F-0.20mL/gNS22086、0.10mL/gNS22118、0.02mL/g NS22083、0.04mL/g NS22119、0.04mL/g NS22002和0.02mL/g NS22035。于50℃、120r/min的摇床糖化48h，离心得上清液。将上清液稀释一定倍数后，测定酶解液总糖、葡萄糖、木糖浓度及产率，并以此作为实验结果评价指标。

1.2.4 分析方法

原料及NaOH-过氧乙酸预处理后的固体成分分析：水分、灰分、热水抽出物、1%NaOH抽提物、有机溶剂抽提物、酸不溶木素、综纤维素测定分别按GB/T 2677.2-93、GB/T 2677.3-93、GB/T 2677.4-93、GB/T 2677.5-93、GB/T 2677.6-94、GB/T 2677.8-94、GB/T 2677.10-95进行；纤维素、半纤维素和木质素的分析参照NREL法测定[19]。

酶解液分析：酶解液中总糖采用DNS法测定[20]；葡萄糖采用试剂盒法；木糖采用间苯三酚法测定[21]。酶解液中总糖（以还原糖计）、葡萄糖及木糖产率计算：

式中：y 为酶解液中总糖、葡萄糖或木糖产率，mg/g；m 为酶解液中总糖、葡萄糖或木糖质量，g；0.9为修正系数；w 为经NaOH-过氧乙酸预处理白酒丢糟干重，g。

每组试验做3次重复，以平均值作为分析数据。

2 结果与分析

2.1 白酒丢糟预处理

附表 原料及预处理后白酒丢糟的化学组成Attached table Chemical composition of raw and pretreated spent grains of China spirits

白酒丢糟经NaOH-过氧乙酸预处理后化学组成发生了较大变化。由附表可以看出，预处理后100g白酒丢糟可得63.55g固体产物。纤维素及半纤维素的质量分数分别为48.47%、19.99%，而木质素质量分数仅为8.23%。与未处理的原料相比，只有极少的纤维素发生了水解，绝大部分纤维素保留在固体中，纤维素回收率达到96.20%；小部分半纤维素被溶解，大部分半纤维素保留在固体中，半纤维素回收率达到66.10%；而绝大部分木质素被溶解或分解在NaOH-过氧乙酸预处理液中，木质素的去除率为71.90%。试验结果表明，NaOH-过氧乙酸预处理有效地解除了白酒丢糟中木质素对纤维素及半纤维素的束缚，为纤维素及半纤维素进一步酶解创造了有利条件。

2.2 酶解白酒丢糟

2.2.1 底物浓度对酶解白酒丢糟的影响

改变底物浓度6%、8%、10%、12%、14%、16%（预处理后干白酒丢糟（w/v），下同），添加0.1mL/g纤维素酶NS22086，进行白酒丢糟酶解试验，结果见图1。

由图1可以看出，酶解液中总糖、葡萄糖及木糖浓度随底物浓度的增加，呈现逐渐提高的趋势；当底物浓度为14%时，酶解液中总糖、葡萄糖和木糖浓度分别达到25.43g/L、11.22g/L和10.03g/L；当底物浓度大于14%时，酶解液中总糖、葡萄糖及木糖浓度几乎未增加。CARA C等[22]利用纤维素酶糖化经蒸汽处理的甘蔗渣获得了类似的结果。为了提高酶解液中可发酵糖浓度，需要增加底物浓度。但是底物浓度过高导致酶解过程搅拌困难和酶解抑制剂浓度较高[23]。对该因素进行方差分析，其p<0.05，说明底物浓度对酶解白酒丢糟有显著影响。

图1 底物浓度对酶解白酒丢糟效果的影响Fig.1 Influence of substrate concentration on the enzyme hydrolyzation of spent grains of China spirits

2.2.2 纤维素酶NS22086添加量对酶解白酒丢糟的影响

底物浓度14%，分别添加0.05mL/g、0.10mL/g、0.15mL/g、0.20mL/g、0.30mL/g纤维素酶NS22086进行丢糟酶解试验，结果见图2。

图2 NS22086添加量对酶解白酒丢糟效果的影响Fig.2 Influence of NS22086 loading on the enzyme hydrolyzation of spent grains of China spirits

由图2可以看出，随着NS22086添加量的增加，酶解液中总糖、葡萄糖和木糖浓度，呈现渐增的趋势。当NS22086添加的量为0.20mL/g时，酶解液中总糖、葡萄糖及木糖浓度达到41.33g/L、26.43g/L和11.95g/L；当NS22086添加量大于0.20mL/g时，酶解液中总糖、葡萄糖及木糖浓度增加不多。对该因素进行方差分析，其p<0.01，说明NS22086添加量对酶解白酒丢糟有极显著影响。

另外计算结果表明，酶解液中葡萄糖与木糖浓度之和低于总糖浓度，由此推测糖化水解液中还存在寡糖（如纤维二糖等）。这与ZHAOX B等[5]用纤维素酶和β-葡萄糖苷酶糖化经NaOH-过氧乙酸预处理的甘蔗渣的试验结果类似。因此，在后续试验中补充β-葡萄糖苷酶进一步水解纤维二糖等寡糖，并消除寡糖对酶解过程的抑制。

2.2.3 β-葡萄糖苷酶NS22118添加量对酶解白酒丢糟的影响

底物浓度14%，在添加0.20mL/g纤维素酶NS22086基础上，分别添加0.01mL/g、0.05mL/g、0.10mL/g、0.15mL/g、0.20mL/gβ-葡萄糖苷酶NS22118进行白酒丢糟酶解试验，结果见图3。

图3 NS22118添加量对酶解白酒丢糟效果的影响Fig.3 Influence of NS22118 loading on the enzyme hydrolyzation of spent grains of China spirits

由图3可以看出，由于纤维二糖等寡糖是纤维素酶水解过程主要抑制物[10-11]，与单独添加NS22086的酶解液相比，随着NS22118添加量的增加，酶解液中总糖和葡萄糖浓度，呈现渐增的趋势；当NS22118添加量为0.10mL/g时，酶解液中总糖和葡萄糖浓度分别达到70.16g/L、40.32g/L，而木糖浓度几乎未增加；当NS22118添加量大于0.10mL/g时，酶解液中总糖、葡萄糖及木糖浓度不再增加。对该因素进行方差分析，其p<0.01，说明NS22118添加量对酶解白酒丢糟有极显著影响。

2.2.4 木聚糖酶NS22083添加量对酶解白酒丢糟的影响

完全降解半纤维素需要半纤维素酶和木聚糖水解酶系协同完成[12]。半纤维素被木聚糖酶水解后，可降低物料对纤维素酶的无效吸附，提高单糖产率。因此，底物浓度14%，在添加0.20mL/g纤维素酶NS22086及0.10mL/gβ-葡萄糖苷酶NS22118基础上，分别添加0.01mL/g、0.02mL/g、0.04mL/g、0.08mL/g、0.16mL/g木聚糖酶NS22083进行白酒丢糟酶解试验，结果见图4。

图4 NS22083添加量对酶解白酒丢糟效果的影响Fig.4 Influence of NS22083 loading on the enzyme hydrolyzation of spent grains of China spirits

由图4可以看出，随着NS22083添加量的增加，酶解液中总糖、葡萄糖及木糖浓度，呈现渐增的趋势；当NS22083添加量为0.02mL/g时，酶解液中总糖、葡萄糖和木糖浓度分别达到96.54g/L、51.21g/L和16.87g/L；当NS22118添加量大于0.02mL/g时，酶解液中总糖、葡萄糖及木糖浓度几乎不再增加。

与添加NS22086和NS22118的酶解液相比，当再补充0.02mL/g的NS22083时，酶解液中总糖、葡萄糖及木糖浓度分别从70.22g/L、40.54g/L和11.35g/L上升至96.54g/L、51.21g/L和16.87g/L。NS22083有效减少了半纤维素对纤维素酶水解的阻碍作用，提高水解过程纤维素的转化率。对该因素进行方差分析，其p<0.01，说明NS22083添加量对酶解白酒丢糟有极显著影响。

2.2.5 复合酶NS22119添加量对酶解白酒丢糟的影响

底物浓度14%，在添加0.20mL/g纤维素酶NS22086、0.10mL/gβ-葡萄糖苷酶NS22118及0.02mL/g木聚糖酶NS22083的基础上，分别添加0.01mL/g、0.02mL/g、0.04mL/g、0.08mL/g、0.16mL/g复合酶NS22119进行白酒丢糟酶解试验，结果见图5。

图5 NS22119添加量对酶解白酒丢糟效果的影响Fig.5 Influence of NS22119 loading on the enzyme hydrolyzation of spent grains of China spirits

由图5可以看出，随着NS22119添加量的增加，酶解液中总糖、葡萄糖及木糖浓度，呈现渐增的趋势；当NS22119添加量为0.04mL/g时，酶解液中总糖、葡萄糖和木糖浓度分别达到101.85g/L、54.68g/L和17.11g/L；当NS22119添加量大于0.04mL/g时，酶解液中总糖、葡萄糖及木糖浓度不再增加。

与添加NS22086、NS22118和NS22083的酶解液相比，当补充0.04mL/g的NS22119时，酶解液中总糖、葡萄糖和木糖浓度分别从96.01g/L、51.21g/L和16.33g/L上升至101.85g/L、54.68g/L和17.11g/L。补充NS22119能有效提高酶解液中可发酵糖浓度。对该因素进行方差分析，其p<0.05，说明NS22119添加量对酶解白酒丢糟有显著影响。

2.2.6 复合酶NS22002添加量对酶解白酒丢糟的影响

底物浓度14%，在添加0.20mL/g纤维素酶NS22086、0.10mL/gβ-葡萄糖苷酶NS22118、0.02mL/g木聚糖酶NS 22083、0.04mL/g复合酶NS22119基础上，分别添加0.01mL/g、0.02mL/g、0.04mL/g、0.08mL/g、0.16mL/g复合酶NS22002进行白酒丢糟酶解试验，结果见图6。

图6 NS22002添加量对酶解白酒丢糟效果的影响Fig.6 Influence of NS22002 loading on the enzyme hydrolyzation of spent grains of China spirits

由图6可以看出，随着NS22002添加量的增加，酶解液中总糖、葡萄糖及木糖浓度，呈现逐渐增大的趋势；当NS22002添加量为0.04mL/g时，酶解液中总糖、葡萄糖和木糖浓度分别从达到106.44g/L、56.73g/L和15.89g/L；当NS22002添加量大于0.04mL/g时，酶解液中总糖、葡萄糖、木糖浓度不再提高。

与未添加NS22002的酶解液相比，当补充0.04mL/g的NS22002时，酶解液中总糖、葡萄糖和木糖浓度分别从101.85g/L、54.68g/L和17.11g/L上升至106.44g/L、56.73g/L和15.89g/L。补充NS22002有效提高酶糖化水解液可发酵糖浓度。对该因素进行方差分析，其p<0.05，说明NS22002添加量对酶解白酒丢糟有显著影响。

2.2.7 葡糖淀粉酶NS22035添加量对酶解白酒丢糟的影响

图7 NS22035添加量对酶解白酒丢糟效果的影响Fig.7 Influence of NS22035 loading on the enzyme hydrolyzation of spent grains of China spirits

底物浓度14%，在添加0.20mL/g纤维素酶NS22086、0.10mL/gβ-葡萄糖苷酶NS22118、0.02mL/g木聚 糖酶NS22083、0.04mL/g复合酶NS22119及0.04mL/g复合酶NS22002基础上，分别添加0.01mL/g、0.02mL/g、0.04mL/g、0.08mL/g、0.16mL/g葡糖淀粉酶NS22035进行白酒丢糟酶解试验，结果见图7。

由图7可以看出，随着NS22035添加量的增加，酶解液中总糖、葡萄糖及木糖浓度，呈现略有增大的趋势，但其浓度没有显著提高；当NS22035添加量为0.02mL/g时，酶解液中总糖、葡萄糖和木糖浓度分别达到107.30g/L、57.44g/L和16.53g/L；当NS22035添加量大于0.02mL/g时，酶解液中总糖、葡萄糖及木糖浓度不再增加。因NaOH-过氧乙酸预处理会除去白酒丢糟中部分淀粉成分或因NS22086、NS22119、NS22118等酶会与NS22035争夺接触原料的机会，补充NS22035对酶解液总糖、葡萄糖及木糖浓度没有显著的提高。对该因素进行方差分析，其p>0.05，说明NS22035添加量对酶解白酒丢糟没有显著影响。

2.3 添加不同酶对酶解白酒丢糟的影响

图8 添加不同酶对酶解白酒丢糟效果的影响Fig.8 Influence of multi-enzyme complex on the enzyme hydrolyzation of spent grains of China spirits

由图8可以看出，添加0.10mL/gβ-葡萄糖苷酶NS22118，酶解液中总糖、葡萄糖浓度分别从41.33g/L、26.43g/L上升至70.16g/L、40.32g/L，木糖浓度变化较小；再添加0.02mL/g木聚糖酶NS22083后，酶解液中总糖、葡萄糖和木糖浓度均有较大提高，其浓度分别从70.16g/L、40.32g/L和11.65g/L上升至96.77g/L、51.42g/L和16.33g/L；再依次添加0.04mL/g复合酶NS22119、0.04mL/g复合酶NS22002和0.02mL/g葡糖淀粉酶NS22035后，酶解液中总糖、葡萄糖和木糖浓度均有不同程度提高，但增幅较小，这是由于复合酶中阿拉伯糖酶、果胶酶及淀粉酶等酶能有效降解物料中的阿拉伯糖、果胶及淀粉等多糖，以致总糖浓度有所提高，但复合酶与原料接触降低了纤维素酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶与原料接触的机会。

同 时 添 加0.20mL/g NS22086、0.10mL/g NS22118、0.02mL/g NS22083、0.04mL/g NS22119、0.04mL/g NS22002和0.02mL/g的NS22035 6种酶，酶解液中总糖、葡萄糖及木糖浓度均达到较好水平，酶解液中总糖、葡萄糖和木糖浓度分别达到107.30g/L、57.44g/L和16.53g/L，对应糖产率分别为659.13mg/g、317.22mg/g和96.01mg/g。这与ZHOU J等[13]将7种纯化酶用于糖化经蒸汽爆破预处理的玉米秸秆相比，所得水解液葡萄糖浓度（57.44g/L）将近其酶解液葡萄糖浓度（15.5g/L）的3.5倍；且与TABKA MG等[14-18]对多酶复配做了大量的研究的试验结果略优。

3 结论

（1）白酒丢糟经NaOH-过氧乙酸预处理（2%NaOH，固液比1:10（w:v），85℃、90min；6%过氧乙酸，固液比1:5（w:v），75℃、90min），固体中96.20%纤维素被保留，71.90%木质素被去除。这有效地解除了木质素对纤维素及半纤维素的束缚，为进一步高效酶解创造了有利条件。

（2）多酶复配糖化经NaOH-过氧乙酸预处理的白酒丢糟，其糖化效果比单一纤维素酶糖化效果好。在添加纤维素酶NS22086的基础上，补充β-葡萄糖苷酶NS22118或木聚糖酶NS22083时，酶解液中可发酵糖浓度均有显著提高；进一步补充复合酶NS22119或复合酶NS22002时，酶解液中可发酵糖浓度均有不同程度提高；补充葡萄糖淀粉酶NS22035时，效果不明显。

（3）底物浓度14%（w/v），在添加0.20mL/g纤维素酶NS22086的基础上，补充0.10mL/gβ-葡萄糖苷酶NS22118、0.02mL/g木聚糖酶NS22083、0.04mL/g复合酶NS22119、0.04mL/g复合酶NS22002及0.02mL/g葡萄糖淀粉酶NS22035，经48h糖化水解，得到酶解液中总糖（以还原糖计）、葡萄糖和木糖浓度分别为107.30g/L、57.44g/L和16.53g/L，酶解液中总糖、葡萄糖和木糖产率分别为659.13mg/g、317.22mg/g和96.01mg/g（预处理后干丢糟）。

（4）从白酒厂可持续发展出发，还需进一步对多酶复配糖化白酒丢糟工艺进行系统优化研究，以降低生产成本。

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