白藜芦醇等芪类合成酶研究进展

周 晋，李顺祥，曹 亮，虢小翊，颜新培，黄 丹

（1.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；2.湖南农业大学生物科技学院，湖南 长沙 410128；3.湖南省蚕桑科学研究所，湖南 长沙 410127）

芪类（Stilbenes）是具有均苯二烯母核或其聚合物的一类物质总称[1]，由于其在植物生理学、药物学和在人类健康中的潜在价值而被广泛研究[2]，其中白藜芦醇和氧化白藜芦醇是最有代表性的芪类成分。白藜芦醇是植物在抵御生物或非生物胁迫中产生的植物保护素[3]，广泛存在于葡萄等植物中。氧化白藜芦醇（oxyresveratrol）抑制黑色素的作用可以达到美白，祛斑的作用，主要应用于化妆品[4]，存在于桑等植物中。本文就白藜芦醇等芪类化合物的合成酶及合成基因的相关研究进行综述。

1 芪类化合物的合成酶及生物合成组织特异性

1.1 合成酶结构功能

芪类是苯丙酸途径合成的简单化合物，该途径最关键的酶是芪合酶（malonyl-CoA:4-coumaroyl-CoA malonyltransferase；EC 2.3.1.95；stilbene synthase STS）[5]，STS在植物中多以基因家族存在，已克隆的STS可分为2种类型。一种为白藜芦醇合成酶 （3,5,4'-三羟基二苯乙烯合酶），以4-香豆酰-CoA和丙二酰-CoA为底物合成白藜芦醇；另一种为赤松素合成酶，合成赤松素（Pinosylvin）[6]。

STS是带一个亚基的二聚体，分子量为43 000 道尔顿，等电点5.4[7]。T Lanz等[8]对STS和CHS的6个保守Cys进行定点突变分析，发现只有169位的Cys对两种酶是必需的。王冰梅等[9]通过对花生白藜芦醇合酶基因DNA 的克隆，并与几种芪合酶及查尔酮合酶的DNA 序列比较证实，芪合酶结合底物的活性中心半胱氨酸（Cys）位置一般为Cys164或Cys169。

1.2 生物合成组织特异性

Wang W等[10]研究葡萄中白藜芦醇积累的组织特异性及白藜芦醇合酶蛋白水平的调节机制和组织定位，发现葡萄幼株茎的韧皮部含量最高，叶中含量最低；而芪合酶mRNA和酶蛋白含量在叶中最高；亚细胞定位发现不同组织的细胞壁芪合酶分布最多；紫外光照射下，白藜芦醇和芪合酶在葡萄叶中都被强烈刺激，表明白藜芦醇和芪合酶都有器官或组织特异性。Fornara V等[11]研究了芪合酶在葡萄果实发育期在浆果中的定位，发现白藜芦醇的顺反异构体主要在外果皮中积累；亚细胞定位发现芪合酶主要在囊泡中。

2 芪类合成相关酶基因的研究

2.1 芪合酶基因结构功能

芪合酶中的白藜芦醇RS基因序列被广泛报道并在GENEBANK注册，如从东方白松（Pinus strobus）克隆到2个芪合酶基因[12]。从日本红松（Pinus densiflora）中分离得到1个STS cDNA[13]。从大黄的根茎中发现1个RtSTS[14]基因。白藜芦醇RS基因 序列分析显示5'上游-33位点存在TATA盒子，编码区起始于第1个ATG，5'端包含有唯一的内含子（179-547位点），将RS基因的编码区分成两部分[15]。最近发现芪合酶基因启动子的转录起始点接近162bp处是建立诱导表达所必须的[16]。

2.2 芪合酶基因诱导表达

Schmidlin L等[17]克隆了氧化白藜芦醇邻甲基转移酶（resveratrol O-methyltransferase ROMT）基因，并将其转入烟草证实了其活性，且其表达受到紫外线、AlCl3等的诱导。Gamm M等[18]研究发现葡萄霜霉菌在葡萄叶片中、灰葡萄孢菌在葡萄浆果中诱导表达ROMT。Deluc LG等[19]研究发现，水分缺失导致葡萄（Vitis vinifera）浆果中白藜芦醇苷的增加，显著提高芪类合成前体物基因的转录，芪合酶表达增加。大量研究证实芪合酶基因表达的诱导因素包括病原真菌、紫外线[3]、水等生物或非生物胁迫因素。

3 芪合酶基因转基因利用

3.1 抗真菌性的转基因应用

2011年Liu等[20]最新克隆了廖属植物的STS基因，将其用（CaMV）35S启动子进行启动，转化到拟南芥中进行表达，通过HPLC，HPLC-ESI -MS等检测，发现在拟南芥中表达了一个反式-白藜芦醇苷，其表达产物能抑制炭疽病病原体次盘孢（Colletotrichum higginsianum）的孢子产生从而抑制该病菌，由此可见该基因可以加强作物的抗病原菌性和品质，且进一步研究表明转基因植株种子颜色有变化，花青素水平显著降低，但查耳酮基因的表达没有下调，这可能是因为增加的STS的活性导致查耳酮合酶前体的缺乏从而干扰接下来的黄酮类的合成。转芪合酶基因进行抗病性研究一直是众多研究者热衷的方向。

3.2 转基因次生代谢产物合成特征

Lo C等[21]采用（LC/MS/MS）分析高粱芪合酶基因在拟南芥中表达合成的白藜芦醇糖基化产物。发现白藜芦醇二糖苷含量达到2.79 mg/g。Schwekendiek A等[22]将组成型表达的芪合酶基因转入啤酒花（Humulus lupulus L.）检测发现云杉新甙的含量达560 mg/g湿重，而非转基因的对照没有产生。Giovinazzo等[23]研究发现，葡萄芪合酶基因转入到番茄中，能够合成反式白藜芦醇及反式白藜芦醇苷。然而伴随着RS基因的转入，某些植物性状出现变异。Fischer等[24]葡萄白藜芦醇RS基因转人到烟草中，虽获得了高含量白藜芦醇的烟草，但其花粉失去活力，花色改变。Hanhineva K等[25]将编码葡萄芪合酶的NS-Vitis3基因转入到草莓，发现肉桂酸、阿魏酸盐有所增加，黄酮类含量降低，而白藜芦醇没有检测到。苗晓燕等[26]研究表明，在转白藜芦醇合成酶基因的虎杖毛状根中，白藜芦醇苷的含量均得到显著提高，而白藜芦醇含量提高不显著。由众多研究可以看出，转RS基因不一定能得到白藜芦醇这一次生代谢产物，多为其结构类似物，转基因对植物的性状和其它次代产物的合成有一定影响，其中涉及到广泛的生理生化过程。

4 应用前景及展望

植物抗病育种和生物活性成分的有效利用是开展对芪类化合物合成相关酶研究的动力，白藜芦醇等活性物质的有效利用对现代医疗保健具有重要意义，如白藜芦醇的保健作用，氧化白藜芦醇的护肤等重要应用，正推动着产业的发展。通过基因工程的手段对芪类成分合成酶基因进行合理的利用，有望在植物抗病育种，天然药物开发等方面取得重大成绩。但同时还应注意到芪合酶转基因过程中出现的安全和植物性状改变等问题，并且要协调好植物自身的代谢产物的关系。

[1]斯建勇.天然芪类化合物的研究概况[J].天然产物研究与开发,1994,6(4):71-79.

[2]Jeandet P,Delaunois B,Conreux A,et al.Biosynthesis,metabolism,mo lecular engineering,and biological functions of stilbene phytoalexins in plants[J].Biofactors,2010,36(5):331-341.

[3]Tang K,Zhan JC,Yang HR,et al.Changes of resveratrol and antioxidant enzymes during UV-induced plant defense response in peanut seedlings[J].J Plant Physiol,2010,167(2):95-102.

[4]Christian Breuer,Gerald Wolf,Shaida A.Andrabi.Blood-brain barrier permeability to the neuroprotectant oxyresveratrol[J].Neuroscience Letters,2006,393:113-118.

[5]Delaunois B,Cordelier S,Conreux A,et al.Jeandet P.Molecular engineering of resveratrol in plants[J].Plant Biotechnol J,2009,7(1):2-12.

[6]Schwekendiek A,Pfeffer G,Kindl H.Pine stilbene synthase Cdna.a tool for probing environmenta1 stress[J].FEBS Lett,l992,301(1):4l-44.

[7]Liswidowati ME.HohmannF.Induction of stibene synthade by Botrytis cinerea incultured grapevine cells[J].Planta,1991,183(2):307-314.

[8]Lanz T,Tropf S,Marner F J,et a1.The role of cysteines in polyketides synthases,site-directed mutagenesis of resveratrol and chalcone synthase[J].Biol Chem,1991,266:9 971-9 976.

[9]王冰梅,潘海芳,叶冰莹,等.花生白藜芦醇合酶基因的DNA克隆及序列分析[J].福建师范大学学报(自然科学版),2005,21(3):56-60.

[10]Wang W,Tang K,Yang HR,et al.Distribution of resveratrol and stilbene synthase in young grape plants (Vitis vinifera L. cv.Cabernet Sauvignon)and the effect of UV-C on its accumulation[J].Plant Physiol Biochem,2010,48(2-3):142-152.

[11]Fornara V,Onelli E,Sparvoli F,et al.Localization of stilbene synthase in Vitis vinifera L. during berry development.Protoplasma[J].2008,233(1-2):83-93.

[12]Raiber S,Schroder G,SchroderJ.Molecular and enzymatic characterization of two stilbene synthases from Eastern white pine(Pinus strobus).A single Arg／His difference determines the activity and the pH dependence of the enzymes[J].FEBS Lett,1995,361(2-3):299-302.

[13]Atsushi Kodan,Hiroyuki Kuroda,Fukumi Sakai,et a1.A stilbene synthase from Japanese red pine(Pinus densiflora):Implications for phytoalexin aocumulation and down regulation of flavonoid biosynthesis[J].PNAS,2002(99)5:3 335-3 339.

[14]Samappito S,Page JE,Schmidt J,et al.Aromatic and pyronepolyketides synthesized by a stilbene synthase from Rheum tataricum[J].Phytochemistry,2003,62(3):313-323.

[15]Hain G.,Reif H.J,Krause Elvira,et al.Disease resistance results from foreign Phytoalexin expression in a novel plant[J].Nature,1993,361:153-156.

[16]Xu W,Yu Y,Zhou Q,et al.Expression pattern, genomic structure,and promoter analysis of the gene encoding stilbene synthase from Chinese wild Vitis pseudoreticulata[J].J Exp Bot,2011,62(8):2 745-2 761.

[17]Schmidlin L,Poutaraud A,Claudel P,et al.stress inducible resveratrol O- methyltransferase involved in the biosynthesis of pterostilbene in grapevine[J].Plant Physiol,2008,148(3):1 630-1 639.

[18]Gamm M,Héloir MC,Kelloniemi J,et al.Identif i cation of reference genes suitable for qRT-PCR in grapevine and application for the study of the expression of genes involved in pterostilbene synthesis[J].Mol Genet Genomics,2011,285(4):273-285.

[19]Deluc LG,Decendit A,Papastamoulis Y.Water deficit increases stilbene metabolism in Cabernet Sauvignon berries[J].J Agric Food Chem,2011,59(1):289-297.

[20]Liu Z,Zhuang C,Sheng S,et al.Overexpression of a resveratrol synthase gene (PcRS)from Polygonum cuspidatum in transgenic Arabidopsis causes the accumulation of trans-piceid with antifungal activity[J].Plant Cell Rep,2011,30.

[21]Lo C,Le Blanc JC,Yu CK,et al.Detection, characterization,and quantification of resveratrol glycosides in transgenic arabidopsis a over-expressing a sorghum stilbene synthase gene by liquid chromatography /tandem mass spectrometry[J].Rapid Communications in Mass Spectrometry,2007,21(24).

[22]Schwekendiek A,Spring O,Heyerick A,et al.Constitutive expression of a grapevine stilbene synthase gene in transgenic hop (Humulus lupulus L.)yields resveratrol and its derivatives in substantial quantities[J].J Agric Food Chem,2007,55(17):7 002-7 009.

[23]Giovinazzo,Giovanna,D Amico,et a1.Antioxidant metabolite prof i les in tomato fruit constitutively expressing the grapevine stilbene synthase gene[J].Plant Biotechnology Journal,2005,3(1):57-69.

[24]Fischer R,Budde I,Hain R.Stilbene synthase gene expression causes changes in flower colour and male sterility in tobacco[J].Plant J,l997,11(3):489-498.

[25]Hanhineva K,Kokko H,Siljanen H,et al.Stilbene synthase gene transfer caused alterations in the phenylpropanoid metabolism of transgenic strawberry (Fragaria x ananassa)[J].J Exp Bot,2009,60(7):2 093-2 106.

[26]苗晓燕,于树宏,沈银柱,等.利用基因转化提高虎杖毛状根中活性成分的含量[J].药学学报,2007,42(9):995-999.