靶向HER2基因的siRNA联合卡铂对肺腺癌A549细胞的抑制作用

曹新梅，张岱权，王 栩，任德莲，刘代玉

(1泸州医学院，四川泸州646000;2泸州医学院附属医院)

HER2基因是一种具有酪氨酸激酶活性的膜表面受体。该受体数量、结构的异常变化常可导致细胞生长异常及癌肿的形成。有文献报道［1］，1/3以上的非小细胞肺癌存在HER2蛋白过度表达。2010年7月～2011年12月，我们观察了靶向HER2基因的siRNA联合卡铂对肺腺癌A549细胞的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺腺癌A549细胞株(由泸州医学院免疫学实验室提供)。RPMI 1640(美国Invitrogen公司)、小牛血清(天津海洋生物)。焦碳酸二乙酯(DEPC)(美国Sigma公司)，LIPOFECTAMINE 2000 Reagent、Trizol(美国Invitrogen公司)，实时荧光定量PCR试剂盒(日本TOYOBO公司)，卡铂(齐鲁制药有限公司)，SABC免疫组化试剂盒(丹麦DAKO公司)，AnnexinⅤ-FITC Kit凋亡试剂盒(凯基公司)。

1.2 方法

1.2.1 肺腺癌A549细胞培养及分组 肺腺癌A549细胞株常规培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基。取对数生长期肺腺癌A549细胞制备成细胞悬液，接种于6孔板。当细胞融合40% ～60%时，分为6组进行转染:2621组、1724组、1491组(数字为合成3对HER2 siRNA的代码)、阴性对照组、GAPDH阳性对照组和空白组，每组3个复孔。以LIPOFECTAMINE 2000 Reagent为转染试剂，按照说明书进行siRNA转染。

1.2.2 实时荧光定量RT-PCR检测HER2 mRNA水平 转染24 h后，用Trizol试剂抽提每组细胞的总RNA，逆转录，按照试剂盒说明行实时荧光定量PCR。反应条件:95℃预变性10 s，95℃变性10 s，60℃退火15 s，40个循环。运用 MyiQTMOptical Module的电脑软件分析系统对实时荧光定量PCR反应结果进行分析。

1.2.3 免疫组化检测肺腺癌A549细胞HER2蛋白表达水平 将经多聚赖氨酸包被处理过的玻片放入6孔板中，接种肺腺癌A549细胞，进行转染。转染48 h后，取出玻片，用PBS冲洗2次，在中性甲醛中固定，SABC常规免疫组化方法检测HER2蛋白的表达水平。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 实验分组:①空白组;②阴性siRNA组;③阴性siRNA+卡铂(40或60 mg/L)组;④2621组;⑤2621+卡铂(40或60 mg/L)组;⑥1724组;⑦1724+卡铂(40或60 mg/ L)组;⑧卡铂(40或60 mg/L)组。收集每组细胞，PBS洗涤细胞2次，加入Binding Buffer 500 μL重悬细胞;置入5 μL AnnexinⅤ-FITC混匀后，加入5 μL PI，混匀;室温、避光反应10 min，上流式细胞仪检测。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件，计量资料以s表示，多样本均数两两比较采用q检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HER2 mRNA及蛋白水平比较 见表1。

表1 各组HER2 mRNA及蛋白水平比较(s)

表1 各组HER2 mRNA及蛋白水平比较(s)

注:与2621组、1724组比较，*P＜0.05

蛋白2621组组别 n HER2 mRNA HER2 3 1.00±0.00 9.93±2.03 1724组 3 1.48±0.23 12.72±1.34 1491组 3 5.79±3.52* 16.59±2.44*阴性对照组 3 8.30±0.23* 20.62±0.52*空白组 3 － 20.07±1.80*

2.2 各组细胞的凋亡率比较 各组细胞的凋亡率的差异性有统计学意义(F=373.74，P＜0.01)，HER2 siRNA+卡铂组细胞的凋亡率均高于对应浓度的卡铂组。见表2。

3 讨论

卡铂是第2代铂类化疗药，在治疗肺癌方面有较好疗效，能提高肿瘤控制率和患者生存率。但其毒副作用可严重影响患者的生存状况和远期疗效。

RNAi可应用特异的siRNA有效抑制内源性基因的表达。由于RNAi具有高效、特异、快速、毒副作用小等优点，且能在转录后水平显著抑制肿瘤相关基因的表达，因而可望成为肿瘤基因治疗的有效手段。本实验共设计3对HER2 siRNA转染HER2基因高表达的肺腺癌A549细胞，结果显示，2621和1724组能抑制该基因的表达，与申萍等［2］的研究结果相似。

表2 各组肺腺癌A549细胞的凋亡率比较(s)

注:与阴性siRNA+卡铂60 mg/L组、1724+卡铂60 mg/L组、卡铂60 mg/L组、2621+卡铂40 mg/L组、2621组、阴性siRNA组、空白组比较，▲P＜0.05;与阴性siRNA+卡铂40 mg/L组、卡铂40 mg/ L组比较，★P＜0.05;与1724+卡铂40 mg/L组、1724组、阴性siRNA组、空白组比较，◆P＜0.05;与阴性siRNA+卡铂40 mg/L组、阴性siRNA组、空白组比较，■P＜0.05;与卡铂40 mg/L组、空白组比较，●P＜0.05

组别 n 凋亡率(%) 10.23±0.36阴性siRNA组 3 9.68±0.39阴性siRNA+卡铂40 mg/L组 3 15.75±0.05阴性siRNA+卡铂60 mg/L组 3 17.77±0.11■2621组 3 11.33±0.21 2621+卡铂40 mg/L组 3 17.51±0.16★2621+卡铂60 mg/L组 3 20.26±0.55▲1724组 3 11.17±0.15 1724+卡铂40 mg/L组 3 17.41±0.71★1724+卡铂60 mg/L组 3 18.41±0.28◆卡铂40 mg/L组 3 15.30±0.10卡铂60 mg/L组 3 17.93±0.06空白组3●

国内外研究发现，HER2基因高表达与非小细胞肺癌对顺铂、环磷酰胺、6氟尿嘧啶以及阿霉素的耐药性显著相关［3］。Valero等［4］研究发现，抗HER2的单克隆抗体与卡铂、多西他赛联用，治疗HER2基因扩增的转移性乳腺癌有效。本实验研究结果显示，联合应用siRNA和卡铂组细胞的凋亡率均高于对应浓度的卡铂组。

综上所述，HER2 siRNA与卡铂具有协同作用，能够促进A549细胞凋亡，为临床探讨肺腺癌治疗的新途径奠定实验基础。

［1］冯元贤，顾伟勇.C-erbB-2基因产物在耐药非小细胞肺癌的表达［J］.苏州医学院学报，1998，18(6):557-558.

［2］申萍，张方，吴学玲，等.RNA干扰her2/neu基因表达抑制肺癌A549细胞增殖的研究［J］.医学研究生学报，2009，22(3):236-239，243.

［3］王煜霞，姬明丽，李生莹，等.c-erbB-2的表达与非小细胞肺癌多药耐药的关系［J］.新乡医学院学报，2006，23(5):469-472.

［4］Valero V，Forbes J，Pegram MD，et al.Multicenter phaseⅢrandomized trial comparing docetaxel and trastuzumab with docetaxel，carboplatin，and trastuzumab as first-line chemotherapy for patients with HER2-gene-amplified metastatic breast cancer(BCIRG 007 study):two highly active therapeutic regimens［J］.J Clin Oncol，2011，29(2):149-156.