雌激素受体基因多态性与女性类风湿关节炎的关系

瞿茹怡，徐玉梅，郑 洁，陆 咏

(上海市第一人民医院分院，上海200092)

类风湿关节炎(RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病，其发病率为20/ 10万～50/10万［1］，女性多于男性。临床研究显示，75%的女性RA患者在妊娠期间症状缓解，尤其在妊娠最后3个月症状明显改善;90%的RA患者在分娩后数周或数月血清类风湿因子(RF)升高;口服避孕药可缓解病情。这些研究结果表明，雌激素在RA发病中具有重要作用。雌激素主要通过雌激素受体(ER)发挥作用，因而ER基因多态性可能影响雌激素的作用，进而影响RA的发病和临床表现。2008～2011年，我们观察了 RA患者 ER基因rs2234693和rs9340799位点多态性与RA的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择在我院诊治的女性RA患者160例(观察组)，年龄(56.43±9.22)岁，均符合美国风湿病学学会1987年修订的RA诊断标准。同期选择我院健康体检女性150例作为对照组，年龄(57.31±9.92)岁。两组年龄比较具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 所有研究对象入院当天询问病史，包括年龄、起病年龄、病程、关节肿痛个数、关节畸形个数、晨僵情况等。次日晨抽空腹血10 mL，同步留取EDTA抗凝的全血1 mL。全血经离心分离血浆和血细胞后，－80℃冰箱冻存。取血浆采用透射比浊法检测RF;血细胞用于抽提DNA。

1.2.2 ER基因型分析 ①DNA抽提:选择DNA抽提试剂盒(天根生化科技有限公司)，严格按说明书操作，步骤简述如下:血细胞经裂解后，上硅胶膜吸附柱，然后经洗涤、洗脱等步骤，获得较纯的DNA样品，再用紫外分光光度计(Eppendorf，德国)测定浓度。②目的序列的PCR扩增和测序:根据Gene-Bank提供的ER基因序列，用Primer Express2.0软件设计引物(引物由上海生工合成)，ER基因多态性位点rs2234693(C/T)和rs9340799(A/G)位点测序的引物序列:上游引物:5'-ACAATTCTCCTGCTTTGGCC-3'，下游引物:5'-GAGACCAATGCTCATCCCAAC-3';PCR反应条件:95℃预变性5 min，94℃30 s，62℃ 40 s，72℃ 60 s。共35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物送华大基因公司测序。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件，等位基因频率采用直接计数法，Hardy-Weinberg检验证实有群体代表性。计数资料比较采用χ2检验，计量资料比较采用t检验和方差分析，非正态分布的数据采用非参数检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ER基因rs2234693、rs9340799位点测序结果两组均经测序分型，结果见图1。rs2234693位点在两组中存在C或T两种变异(左侧第6个碱基)，其基因型分别为TT、CT、CC型;rs9340799位点在两组中存在A或G两种变异(右侧第6个碱基)，其基因型分别为AA、AG、GG型。

2.2 两组ER基因rs2234693和rs9340799位点多态性比较 根据SNP位点rs2234693、rs9340799的基因型，2个位点排列组合，可得9种基因型:CC/ GG、TG/GG、TT/GG、CC/GA、TC/GA、TT/GA、CC/ AA、TC/AA和TT/AA。两组基因型比较见表1。

图1 ER基因rs2234693和rs9340799位点测序结果

2.3 两组ER等位基因和基因型比较 见表2。

2.4 观察组ER基因型与RA临床表现的关系GG、AG、AA、CC、TC、TT六种基因型在起病年龄、病程、关节肿痛数和关节畸形数、晨僵和RF阳性率均无统计学意义。见表3。

2.5 观察组ER基因型多态性与RA临床表现的关系 CC/GG、TG/GG、TT/GG、CC/GA、TC/GA、TT/ GA、CC/AA、TC/AA和TT/AA九种基因型与起病年龄、病程、关节肿痛数、晨僵和RF阳性率无统计学意义。关节畸形数TT/GA型少于CC/GG、TG/GG、TC/GA、CC/AA、TC/AA和TT/AA型，其他基因型间无统计学意义。由于各组例数较少，TT/GA型仅有8例，这种差异是否有临床意义，需进一步扩大样本验证。见表4。

表1 两组ER基因rs2234693(C/T)和rs9340799(A/G)位点多态性比较［例(%)］

表2 两组ER等位基因和基因型比较［例(%)］

表3 观察组ER基因型与RA临床表现的关系

3 讨论

表4 观察组ER基因多态性与RA临床表现的关系

RA是一类关节软组织的慢性炎症性疾病，其发病机制目前尚未完全阐明。多数研究认为与遗传、环境等多因素有关;其中遗传因素有HLA-DRB1和PTPN22等基因，环境因素包括吸烟、感染等。

临床研究发现，雌激素在RA发病中具有重要作用，其通过与ER结合发挥生物学效应。因此，ER基因多态性和变异性将影响雌激素的作用。研究发现，ER多态性(尤其是ERa的基因多态性)可能与乳腺癌、血脂代谢异常、动脉粥样硬化和骨质疏松等有关。目前，关于ER多态性与RA的相关性研究较少。

人体ER基因位于染色体6q24～27区域，由8个外显子和7个内含子组成，全长140 kb，编码一个相对分子质量为66 kD的蛋白质。ER位于胞核或胞质内，与雌激素结合后，具有转录因子的作用。ER与雌激素结合后转位至核内，与靶基因中的雌激素反应元件特异性结合，调节靶基因的转录。研究发现，1号内含子具有重要的转录调节功能，该区域碱基的改变(SNP或突变)会影响ER的表达和功能。据报道［2］，1号内含子中rs2234693(C/T)和rs9340799(A/G)位点多态性与ER的表达和功能有关，可影响雌激素的作用。

国内外的研究显示，ER基因 rs2234693和rs9340799位点多态性与多种疾病有关，如乳腺癌、骨质疏松症以及复发性流产等［3］。Ushiyama等［4］发现，日本女性ERa PPxx基因型较XXPP、xxpp基因型RA发病早;同时还发现，ER基因rs2234693和rs9340799位点的不同亚型与RF及类风湿结节的出现无明显相关性。Takagi等［5］研究发现，ER基因亚型虽与RA的发病年龄、RF阳性率以及腕骨的骨密度变化无明显相关性，但与RA的发病有关。国内苏茵等研究发现，我国女性RA的发病与ER基因XbaⅠ和PvuⅡ酶切多态性存在密切的相关性，其通过分析RA患者ER基因的多态性发现，X和P的基因频率表达明显增高。说明这两种等位基因可能与RA发病有一定的关系。

本研究发现，观察组CC/GG的基因型阳性率显著高于对照组，TT/AA基因型的阳性率显著低于对照组，其他基因型两两比较无统计学意义;观察组C和G等位基因明显高于对照组，GG和CC基因型也显著高于对照组，而AA和TT基因型明显低于对照组;2个位点的杂合型在组间没有差异。表明C和G等位基因可能是RA发病的危险因素，而A和T等位基因可能是保护因素。分析GG、AG、AA、CC、TC、TT六种基因型，可见起病年龄、病程、关节肿痛数和关节畸形数、晨僵和RF阳性率在组间均未见显著差异，提示ER基因rs2234693和rs9340799位点多态性与RA的发病有关，而与病情严重程度无关。进一步分析CC/GG、TG/GG、TT/GG、CC/GA、TC/GA、TT/GA、CC/AA、TC/AA和TT/AA九种基因型多态性与起病年龄、病程、关节肿痛数和关节畸形数、晨僵和RF阳性率之间的关系，组间亦未见显著差异。这和前人的研究结果［5，6］基本一致。表明ER rs2234693和rs9340799两个位点的基因多态性可能仅与RA的发病有关。关节肿痛数和关节畸形数、晨僵和RF阳性率等可能有多种因素参与有关，如炎症因子(TNF-a，IL-6及其受体)［7，8］、治疗时间及治疗方案等。

总之，ER基因rs2234693和rs9340799位点的多态性与RA的发病相关，雌激素在RA的发生、发展中可能具有重要作用。

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［4］Ushiyama T，Mori K，Inoue K，et al.Association of oestrogen receptor gene polymorphisms with age at onset of rheumatoid arthritis［J］.Ann Rheum Dis，1999，58(1):7-10.

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［6］Dziedziejko V，Kurzawski M，Safranow K，et al.Oestrogen receptor polymorphisms in female patients with rheumatoid arthritis［J］.Scand J Rheumatol，2011，40(5):329-333.

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［8］Nishimoto N，Terao K，Mima T，et al.Mechanisms and pathologic significances in increase in serum interleukin-6(IL-6)and soluble IL-6 receptor after administration of an anti-IL-6 receptor antibody，tocilizumab，in patients with rheumatoid arthritis and Castleman disease［J］.Blood，2008，112(10):3959-3964.