HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌CaSki细胞生物学活性的影响

(1三峡大学分子生物研究所，湖北宜昌 443002;2三峡大学第二临床医学院;3湖北医药学院附属太和医院)

流行病学调查显示，高危型人乳头瘤病毒(HPV)16型感染与宫颈癌的发生有密切关系。其编码的E7蛋白与细胞转化和病毒复制的调控有关，能在宫颈癌组织内及细胞系持续表达，在维持转化组织恶性表型的过程中具有重要作用［1］。因此，以E7基因为靶点的宫颈癌基因治疗已成为研究热点。RNA干扰(RNAi)技术是一种封闭基因表达的有效方法，能通过小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA来介导RNAi作用［2］。2011年7月 ～2012年2月，我们探讨了HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌CaSki细胞生物学活性的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 宫颈癌细胞株CaSki、载体pSilenceU6由本研究所保存。Trizol总RNA纯化试剂和LipofectamineTM2000购自 Invitrogen公司;限制性内切酶、T4连接酶及Taq DNA聚合酶均购自Fermentus公司。兔抗HPV16 E7单抗和β-acting鼠抗人多克隆抗体购自Santa cruz。RPMI 1640细胞培养基购自Sigma公司。EPICSXL-4流式细胞仪为Beckman Coulte公司产品，PCR引物合成及DNA测序由上海生工公司完成。GelLogic-200凝胶图像分析仪为美国Kodak公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及传代 将人宫颈癌CaSki细胞置于含10%小牛血清及1%青霉素(或链霉素)的RPMI 1640细胞培养基中，在5%CO2、37℃、80%湿度的细胞培养箱中传代培养。细胞传代方法:PBS润洗后，胰蛋白酶消化至轻拍细胞脱落;用培养液终止后转至15 mL离心管，800 r/min离心3 min，弃上清液;细胞用培养液重悬后，以1∶3的比例传代。

1.2.2 HPV16 E7特异性siRNA表达载体的构建利用 Ambion网站 siRNA Designer设计靶向HPV16 E7 siRNA靶序列，采用BLAST软件对选择的靶序列进行同源分析，从HPV16 E7 mRNA基因中选择一段19个碱基的E7特异性序列，设计1对63 bp的寡核苷酸，包括内切酶位点及茎环结构。HPV16 E7 siRNA靶序列上游引物:5'-GATCCGCAACAGTTACTGCGACGTTTCAAGAGAACGTCGCAGTAACTGTTGCTTTTTTGGAAA-3';下游引物:5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCAACAGTTACTGCGACGTTCTCTTGAAACGTCGCAGTAACTGTTGCG-3'。对照序列中上游引物:5'-GATCCGTGACTAGCAACGTCGTACTTCAAGAGAGTACGACGTTGCTAGTCACTTTTTTGGAAA-3';下游引物:5'-AGCTTTTCCAAAAAAGTGACTAGCAACGTCGTACTCTCTTGAAGTACGACGTTGCTAGTCACG-3'。所得引物的cDNA片段克隆入经HindⅢ和BamHⅠ酶切的真核转录质粒载体pSilenceU6中。用分子克隆技术获得阳性重组质粒pSilenceU6 HPV16 E7(E7Si)以及乱码对照质粒pSilenceU6 HPV16 E7-ctl(Si)。

1.2.3 细胞转染及筛选 待CaSki细胞贴壁覆盖率70% ～90%时，将表达载体E7Si及空载体Si按LipofectamineTM2000试剂说明书分别进行转染。通过潮霉素(0.8 mg/mL)抗性筛选，转染20 d后分别得到抗性克隆细胞CaSki-E7Si及阴性对照CaSki-Si。

1.2.4 RT-PCR法检测HPV16 E7 mRNA的表达用0.8 mL Trizol试剂裂解细胞，转至无RNase的1.5 mL EP管中;加入160 μL氯仿，颠倒混匀，室温静置10 min，待两液相分层后，4℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清液至新的EP管中;加异丙醇500 μL，颠倒混匀，室温静置10 min，4℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清液;加75%乙醇(DEPC水配制)1 mL，洗涤沉淀，4℃ 7 500 r/min离心5 min后，弃上清液并风干，用适量去RNase水溶解沉淀，获得细胞总RNA，经反转体系得到cDNA。再以此cDNA第1链为模板，以β-actin和HPV16 E7为引物进行PCR扩增。

1.2.5 流式细胞术鉴定克隆细胞HPV16 E7的表达 将在mRNA水平沉默较好的CaSki-E7Si以及空载的CaSki-Si细胞进行培养，待长到80% ～90%用胰酶消化分别收集细胞，各用3 mL PBS重悬，每种细胞分装到2个流式管中，每管各取1 mL再次用3.5 mL PBS 洗涤，800 r/min 离心 3 min，去上清;用0.1%TritonX-100-PBS室温处理10 min，PBS洗涤3次(2 000 r/min离心5 min)，去上清;将HPV16 E7的抗体按1∶800稀释，每管中各加入100 μL，在室温下孵育30 min。用PBS洗涤3次(2 000 r/min离心5 min)，将FITC标记的二抗按1∶500稀释，每管中加入100 μL，室温下避光孵育30 min。最后用PBS洗涤3次(2 000 r/min离心3 min)，用500 μL的PBS重悬细胞上机检测。

1.2.6 细胞增殖的检测 分别收集处于对数生长期空载CaSki-Si和CaSki-E7Si的克隆细胞，胰蛋白酶消化后，用RPMI 1640培养液重悬，调整细胞密度为1×104/mL后接种于96孔板中，每孔100 μL。待细胞完全贴壁后，去培养液，加入100 μL MTT(200 μg/mL)，置于37 ℃孵育4 h，去上清液，加入DMSO 200 μL/孔，待完全溶解后于570 nm波长处检测吸光度(OD)值，以此检测时间点作为0 h。用同样方法检测细胞培养24、48、72和96 h各时间点的OD值，以各时间点的OD值与0 h OD值的比值反映细胞生长速度。

1.2.7 流式细胞术检测细胞周期和化疗药物的敏感性 ①将空载CaSki-Si和CaSki-E7Si的克隆细胞分在6孔板中培养，待细胞长到70% ～80%用胰酶消化收集细胞，将收集的细胞存放于EP管中，用PBS混匀，2 500 r/min离心5 min，吸去上清废液，用80%的乙醇(PBS配制)4℃固定。次晨取出固定好的细胞，2 500 r/min离心5 min后吸去上清废液;再次加入PBS于EP管中混匀，2 500 r/min离心5 min后吸净废液，用500 μL含0.1%TritonX-100和50 μg/mL RNase的PBS混合液重悬细胞，然后加入0.5 mg/mL碘化丙锭90 μL，于37℃避光保温30 min;尼龙膜过滤，用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。②将起始浓度为900 ng/mL顺铂(DDP)3倍梯度稀释3个浓度备用;待铺在6孔板中空载CaS-ki-Si和CaSki-E7Si的克隆细胞贴壁后，加入上述3个浓度的DDP培养液，再次培养48 h后收集细胞。按上述方法检测细胞周期。

1.2.8 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以±s表示，结果比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV16 E7 siRNA的构建 将用分子克隆技术成功筛选出的重组质粒pSilenceU6 HPV16 E7和乱码对照的pSilenceU6 HPV16 E7-ctl送上海生工测序。该重组质粒经DNA测序分析证实，重组质粒中插入的片段方向正确，碱基无突变。

2.2 克隆细胞株的鉴定 将获得的空载CaSki-Si和CaSki-E7Si的克隆细胞株放大培养后，在蛋白和mRNA水平上筛选稳定沉默HPV16 E7表达的细胞株。结果显示，在所得的阳性克隆株HPV16-E7Si中，HPV16-E7Si-1在mRNA(图1泳道3)和蛋白水平上(图2)的表达量均显著低于对照细胞株空载Si。

图1 mRNA水平鉴定HPV6 E7在克隆细胞株的表达

2.3 克隆细胞株活性的检测

2.3.1 沉默HPV16 E7基因对CaSki细胞增殖的影响 用MTT比色法检测克隆细胞株E7Si与对照Si的增殖速率。结果显示，从培养48 h开始，克隆细胞株的生长要明显慢于对照细胞Si(P＜0.05)，提示沉默HPV16 E7基因后抑制CaSki细胞增殖。见图3。

2.3.2 沉默HPV16 E7基因对CaSki细胞周期的影响 用流式细胞仪检测沉默HPV16 E7基因后对CaSki细胞周期的影响。结果发现，克隆细胞株E7Si凋亡峰比例明显增多(40.9%vs 7.03%，P ＜0.01)。

图2 流式细胞仪检测CaSki细胞中E7蛋白的沉默

图3 沉默HPV16 E7基因对CaSki细胞增殖的影响

2.3.3 沉默HPV16 E7基因后对DDP敏感性的影响 将起始浓度为900 ng/mL的DDP稀释后作用于克隆细胞E7Si和对照空载Si细胞，培养48 h后收集细胞，用流式细胞仪检测DDP对HPV16 E7基因沉默后细胞周期的影响。结果显示，克隆细胞株E7Si G0～1期细胞明显增多，阻止细胞于 DNA的合成前期，而对照Si则更多地是阻止细胞于合成期(S+G2+M)(P ＜0.05)。见表1、2。

表1 DDP对CaSki-E7Si细胞株细胞周期的影响(%，±s)

表1 DDP对CaSki-E7Si细胞株细胞周期的影响(%，±s)

注:与 CaSki-E7Si比较，*P ＜0.05

浓度 Sub G0～1 S G2+M CaSki-E7Si 40.9 ±7.11 31.0 ±3.88 5.2 ±0.64 12.5 ±1.06 DDP 900 ng/mL 5.8 ±1.73 53.0 ±6.03* 7.0 ±0.88 23.4 ±2.93*DDP 300 ng/mL 9.5 ±1.19 49.3 ±6.16* 8.0 ±1.20 21.6 ±2.79*DDP 100 ng/mL 17.1 ±1.14 36.7 ±4.59 8.1 ±1.01 17.4 ±2.08

3 讨论

宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤之一，严重威胁妇女生殖健康和生命。研究表明，高危型HPV感染，尤其是16型和18型感染是导致宫颈癌发病的最主要因素［3，4］，病毒早期基因E7可在宫颈癌组织中持续表达，并为癌组织恶性表型的维持所必需［3，5，6］。因此，抑制E7基因在宫颈癌中的过度表达，可以为宫颈癌的基因治疗提供新的线索。

表2 DDP对CaSki-Si细胞株细胞周期的影响(%，±s)

表2 DDP对CaSki-Si细胞株细胞周期的影响(%，±s)

注:与 CaSki-Si比较，*P ＜0.05

浓度 Sub G0～1 S G2+M CaSki-Si 7.0 ±0.58 57.5 ±7.19 6.3 ±0.84 14.6 ±1.83 DDP 900 ng/mL 6.5 ±0.61 13.6 ±2.70 35.8 ±4.48* 18.3 ±2.09 DDP 300 ng/mL 4.3 ±0.54 18.6 ±2.33 10.4 ±1.30 45.9 ±5.04*DDP 100 ng/mL 6.4 ±0.61 22.6 ±2.13 7.4 ±0.93 37.2 ±4.60*

目前RNAi技术已成为基因功能研究和抗病毒治疗的强有力工具［7，8］。本研究采用载体介导的RNAi技术观察其对宫颈癌CaSki细胞HPV16 E7基因的影响。本研究中，我们设计了一条HPV16 E7特异性Si和一条随机乱码Si作为对照，与其他核苷酸链无明显同源性，保证了该siRNA对E7基因mRNA的特异性。构建HPV早期基因E7的siRNA的真核载体，转染到CaSki细胞中，有效沉默靶基因E7的转录表达进而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。同时，转染的非特异siRNA对靶基因未见明显的抑制效应，进一步证实了siRNA的作用具有特异性。用脂质体直接转染的方法，简单易行，且 LipofectamineTM2000在多种细胞转染中均表现出稳定、高效、低毒的特点。上述研究结果初步表明，siRNA载入CaSki细胞的活性有可能成为治疗HPV相关肿瘤的一种新的手段，并为深入探讨E7编码基因在HPV相关肿瘤中的作用奠定了实验基础。

进一步研究发现，HPV16 E7 siRNA表达载体转染宫颈癌CaSki细胞后，凋亡明显增加;但是加用DDP作用于空载Si和HPV16 E7Si细胞株后，DDP将空载 Si的周期阻滞在 S～G2期，而将 HPV16 E7Si细胞大部分阻滞在 G0～1期，说明E7 siRNA表达载体在化疗药物的作用下能阻滞CaSki细胞由G1期进入S期。同时由生长曲线可以看出，HPV16 E7 siRNA表达载体可使CaSki细胞生长增殖减慢，而空载体却无此作用。说明E7 siRNA表达载体可抑制其细胞增殖。分析可能原因如下:①E7基因作为一种癌基因，其主要致癌机制为E7编码蛋白干扰视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)与E2F的结合，使pRb-E2F复合物解离，E2F被游离，从而发挥其转录因子的作用，使细胞由G1期向S期转化，导致细胞调节失控，发生永生化［9］;②DDP是铂的金属络合物，其主要靶点为DNA，破坏其复制而发挥细胞毒作用［10］。细胞通过2个限制点(G1/S期和G2/M期限制点)保证细胞的复制。且有研究表明，细胞周期的阻滞与细胞凋亡、分化密切相关。

综上所述，HPV16 E7 siRNA表达载体可通过有效抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达来调控肿瘤细胞周期，抑制肿瘤细胞的恶性增殖，从而部分逆转其恶性表型，并且增加了DDP的敏感性。因此，通过RNAi干扰联合化疗可为肿瘤治疗提供新的思路。

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