多发性骨髓瘤细胞中c-myc介导的CKS1B转录调控的研究

孟丽娟 许家仁 王峻

多发性骨髓瘤(MM)是血液系统常见的恶性肿瘤，近年来其发病率逐年上升。研究发现CKS1B基因位于染色体1q21，是SCFSkp2泛素化复合体的必要组成部分，能降解许多细胞周期调控因子，在多种肿瘤的发生发展中扮演重要角色。同时，原癌基因c-myc是一重要的转录因子，调节细胞生长、增殖和凋亡，可能在MM的发病中发挥重要的作用。本研究对MM细胞株XG1及XG7中c-myc介导CKS1B的转录调控作用进行研究，现将研究结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 细胞株与细胞培养MM细胞株XG1、XG7(由苏州大学张学光教授建立和赠送)用含IL-6 10 ng/ml、10%胎牛血清(杭州四季青公司产品)的RPMI 1640培养液(Gibco公司)，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，48～72 h传代1次，培养中的细胞均保持在(0.1～0.5)×106/ml的密度，实验用细胞为对数生长期细胞。

1.2 实验方法

1.2.1 构建质粒DNA：以人的基因组DNA和RNA为模板，用KodPlus PCR扩增CKS1B启动子区1000 bp和c-myc mRNA全长，再经Taq 3'末端加A后插入pGEMT-easy载体。经测序确认正确后酶切分别插入荧光素酶报告基因pLG4.70和PCMV6-XL5载体。

最终形成如下质粒：c-myc表达质粒：PCMV6-XL5wtmyc，插入含3.8 kb的c-myc cDNA;对照质粒PCMV6-XL5，不含插入片段;CKS1B启动子报告基因质粒pGL4.70(1000)，含1000 bp CKS1B启动子序列，连接萤火虫荧光素酶报告基因。

1.2.2 质粒转染：24孔板内接种0.5×105/孔MM细胞XG1及XG7，37℃、5%CO2培养过夜后进行转染。按5～10 ng/孔pGL4.75，加入50 μl/孔无血清RPMI 1640，分装并加入150 ng/孔CKS1B启动子报告质粒pGL4.70(1000)、600 ng/孔c-myc表达质粒PCMV6-XL5wtmyc质粒或对照质粒PCMV6-XL5，混匀后加入2 μl/孔Superfect(Qiagene)，再混匀，静置10 min。取含10%胎牛血清RPMI 1640 300 μl/孔加入质粒、Superfect混合物，立即加入去除培养基的24孔板，37℃、5%CO2培养24～48 h。每组3～4复孔，重复3次。

1.2.3 荧光素酶报告试验：去上清，加125 μl/孔被动裂解液(PLB)，室温轻摇15 min，取裂解物10 000 g离心1 min，取上清按说明书用Dual-lucifrase试剂盒(Promega)检测荧光素酶活性，以未作转染的孔作本底加以扣除，以海肾荧光素酶活性为内对照计算萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性比值。

1.2.4 Western免疫印迹：采用RNA干扰技术构建cmyc-shRNA质粒，分别转染XG1、XG7，同时建立XG1-Scramble(XG1-SCR)及XG7-Scramble(XG7-SCR)细胞株作阴性对照。取2×106细胞加蛋白裂解液，离心提取蛋白，通过10%SDS-PAGE胶分离蛋白，100 V，1 h，然后转膜，封闭后加一抗(抗c-myc、CKS1B及β-actin抗体)，室温1 h，洗膜，加二抗，室温0.5 h，成像。

1.2.5 统计学处理：采用SPSS 13.0进行数据统计分析，荧光素酶活性值以均数±标准差(¯x±s)表示，多组均数比较采用ANOVA检验，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光素酶报告试验结果分别构建c-myc编码区序列以及CKS1B上游启动子区1000 bp的荧光素酶报告载体。分成3组，分别为对照组，仅转染PGL4.75质粒;CKS1Bpro组，共转染PGL4.75质粒+CKS1B启动子报告基因质粒pGL4.70(1000)以及PCMV6-XL5空载体;CKS1Bpro+c-myc组，共转染PGL4.75质粒+CKS1B启动子报告基因质粒pGL4.70(1000)以及PCMV6-XL5-myc表达质粒。对照组萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性比值为0.046±0.052，XG1-CKS1Bpro组为0.159±0.067，XG1-CKS1Bpro+c-myc组为0.656±0.086，3组间存在统计学差异(P＜0.05)。XG7-CKS1Bpro组萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性比值为0.162±0.081，XG7-CKS1Bpro+c-myc组为0.663±0.077，3组间存在统计学差异(P＜0.05)。说明c-myc可以转录激活CKS1B启动子活性。

2.2 Western免疫印迹结果采用RNA干扰技术抑制XG1及XG7细胞c-myc基因表达后，Western免疫印迹显示CKS1B蛋白表达下调。见图1。

图1 shRNA干扰沉默Myc基因后对CKS1B基因蛋白水平的影响

3 讨论

MM分子细胞遗传学的异质性与临床预后有密切的关系。近年研究显示1q21扩增(amp1q21)是MM最常见的染色体异常之一，与MM疾病进展、复发密切相关，是MM预后差的重要指标之一［1-2］。CKS1B基因是此区域的重要基因，CKS1B基因在MM细胞的过度增殖与存活中起重要作用，其过表达与临床早期死亡高度相关。

人类CKS1B基因编码79个氨基酸蛋白，是SCFSkp2泛素化复合体的必要组成部分，SCFSkp2泛素化复合体能特异性识别磷酸化的底物并介导其泛素化降解，许多细胞周期调控因子都是泛素蛋白酶体途径的底物。其中细胞周期负性调节蛋白p27 kip1是SCFSkp2泛素化和随后蛋白降解的主要靶分子之一，CKS1B促进了Skp2与磷酸化的p27kip1的结合，导致p27kip1泛素化和随后经蛋白酶体降解中起重要作用［3-5］。p27kip1与Cdk2/cyclin A以及Cdk2/cyclinE复合体结合并抑制二者的功能，从而抑制细胞周期G1-S期转换，因此，其降解异常可导致细胞周期紊乱、细胞恶性增殖。在乳腺、胃肠道、肺和卵巢肿瘤和MM中均有报道CKS1B高表达均是通过促进p27kip1降解而导致肿瘤形成和进展，且此类患者预后较差［6-11］。

原癌基因c-myc是一重要的转录因子，可调节约15%的人类靶基因，从而调节细胞生长、增殖和凋亡，在多种肿瘤形成过程中处于重要地位。Old等［12］研究显示在B细胞中c-myc转基因鼠高表达c-myc，并主要是通过诱导CKS1而抑制p27 kip1表达。CKS1基因敲除后延迟了c-myc诱导的淋巴瘤形成。我们通过转录因子结合网站分析确定CKS1B启动子区(起始密码子前805～795个碱基)是myc结合位点，通过荧光素酶报告基因系统体外发现c-myc基因可转录激活CKS1B表达，并在蛋白水平证实c-myc敲除后，CKS1B蛋白表达降低，证实在XG1细胞株中c-myc可调控CKS1B蛋白的表达。本研究发现通过介导CKS1B基因转录调控，c-myc在MM的发病与预后中可能具有重要作用。

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