胸腺肽α1对80岁以上老年人外周血树突状细胞体外培养及功能的影响

张兴虎 钱晓明 齐玉琴 万文辉 赵东宝

树突状细胞(DC)是已知体内功能最强的一类抗原提呈细胞(APC)，其最大的特点就是能有效刺激原始T细胞，诱导初次免疫应答，也能促进B细胞生成抗体及自然杀伤(NK)细胞的激活，处于机体内免疫应答的中心环节［1-3］。应用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)体外可以诱导人外周血单核细胞生成DC(MoDC)，并具有极强的刺激T细胞增殖的能力［4-5］。而胸腺肽α1是一种具有多种效应的免疫增强剂，其除了可以增强NK细胞的能力外，还可以明显促进同种T细胞的增殖［6］。本研究主要是观察≥80岁老年人在应用胸腺肽α1后，外周血单核细胞培养所得到的DC生长、活力、存活时间及刺激T细胞增殖情况的改变。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及设备DC培养基CellGro-DC购自德国CellGenix公司;rhGM-CSF、rhIL-4购自上海飞捷公司;丝裂霉素C购自日本Kyowa Hakko kogyo公司;淋巴细胞分离液购自天津TBD公司;DMSO购自美国Sigma公司;倒置显微镜(Zeiss Axiovert 40)、MTT(噻唑蓝)购自上海生工公司。

1.2 试验对象选取老年人30例，年龄80～96岁，平均(85.6±4.5)岁，其中男22例，女8例。排除肿瘤、糖尿病、慢性感染、自身免疫性疾病、服用免疫抑制剂，并未接受过免疫增强剂的治疗。

1.3 治疗方法给予胸腺肽α1注射剂1.6 mg皮下注射，每周2次，疗程为1月。

1.4 DC体外培养在治疗前后分别将新鲜的抗凝外周血各20 ml，经淋巴细胞分离液梯度离心(20℃，400 g，20 min)，取界面细胞，放入50 ml离心管中，用PBS悬浮细胞，离心(200 g，10 min)洗细胞3次，用Cell-Gro-DC培养基悬浮细胞，加入24孔板，每孔2.5×106细胞/ml培养基，置37℃、5%二氧化碳孵箱(Thermo-Forma)培养2 h后，吸弃上清，用预热的培养基轻轻洗培养板去除非贴壁细胞，即获得贴壁的单核细胞，每孔加1 ml CellGro-DC树突状细胞培养基，rhGM-CSF 100 ng/ml，rhIL-4 4500 U/ml，置37℃、5%二氧化碳孵箱培养，培养第3天每孔补加上述培养基1 ml及细胞因子，培养第7天收集悬浮细胞，即为DC。

1.5 DC形态观察通过倒置显微镜每天观察细胞活力、数量及形态变化。

1.6 混合淋巴细胞反应首先用淋巴细胞分离液分离正常人外周血单个核细胞，置37℃培养2 h后去除贴壁细胞，非贴壁细胞用10%AB血清的RPMI1640完全培养液悬浮，制备获得同种淋巴细胞，96孔板每孔加入同种淋巴细胞5×105。DC用含10%AB血清的RPMI 1640悬浮为5×106细胞/ml，加入丝裂霉素C 25 μg/ml，37℃孵育45 min，RPMI液洗3次，用含10%AB血清的RPMI 1640培养液悬浮细胞，按DC∶T细胞不同比例(1∶10，1∶30，1∶90，1∶270)，将灭活的DC加入96孔板中与同种异体T淋巴细胞混合，每组设3个复孔，终体积为200 μl，另取3孔只加淋巴细胞而不加DC细胞，作为背景对照。置于37℃、5%二氧化碳孵箱培养96 h，于培养结束前4 h每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，继续孵育4 h，1500 r/min，离心5 min，吸去孔内液体，每孔加DMSO 200 μl，震荡摇匀后在37℃放置0.5 h待甲臢结晶完全溶解后，用自动光谱测读仪(molecular device)测定光密度(A)值(570 nm)，结果用3孔均值表示。

1.7 统计学处理数据采用均数±标准差表示，采用SPSS 10.0统计软件包进行t检验比较治疗前后的差异，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DC体外培养生成的情况通过对≥80岁老年人胸腺肽α1治疗前后外周血DC体外培养的观察，发现治疗前DC在培养过程中细胞逐渐死亡，培养孔中的细胞量逐渐较少，培养至第7天部分细胞死亡，留有少量单核样细胞及悬浮的树突状形态的细胞，最终获得的DC数量较少(图1A)，其中有8例未能培养出DC。而治疗后培养细胞的活力保持较好，至第7天全部获得数量较多的DC(图1B)。

图1 体外培养第7天时生成DC的形态(×100)

2.2 DC的体外存活时间培养至第7天获得的DC体外继续培养，治疗前DC继续培养2 d后全部死亡，而治疗后DC体外继续培养可以保持存活5～7 d。

2.3 同种T淋巴细胞刺激能力测定刺激同种T淋巴细胞增殖能力的高低直接反映了DC的功能状况。治疗前DC刺激同种T淋巴细胞增殖能力较弱，在刺激细胞：反应细胞(S∶R)比值为1∶10时A值为0.79±0.11，而治疗后A值为1.23±0.22，治疗前后具有显著的统计学差异(P＜0.05)。

3 讨论

DC在先天性和获得性免疫中扮演了重要的角色。DC是体内功能最强和最活跃的专职APC，体内分布广泛，亚群复杂，能捕获、处理和提呈抗原，并参与淋巴细胞激活、生长和分化，在天然免疫和获得性免疫中均发挥着极其重要的作用，它是识别病原体侵入的第一道防线。机体的免疫识别首先由DC捕获、加工和处理抗原，再将抗原提呈给T、B淋巴细胞，从而引发一系列免疫应答，在体内发挥强大的免疫监视功能。

增龄引起的DC功能的下降减弱了机体免疫防御及免疫监视作用，致使老年人容易患感染、肿瘤和自身免疫性疾病。老年人DC摄取抗原能力的下降减弱了它对抗原的加工和提呈，进而也影响了它激活T细胞的能力。然而目前人们对DC在免疫衰老中所起的作用还不是十分清楚。

胸腺肽α1是一种重要的免疫调节剂，能诱导T细胞的分化，促进T淋巴细胞亚群发育并活化等各种免疫效应，临床上主要用于免疫缺陷症和自身免疫性疾病的治疗。本研究从另一途径研究其对机体免疫增强作用。有实验研究表明直肠肿瘤小鼠模型接受胸腺肽α1加IL-2治疗后，其外周血单核细胞的数量明显增多［7］，≥80岁老年人较普通老年人外周血培养的DC体外的生长活力、T细胞刺激能力明显降低［8］。本研究显示，≥80岁老年人应用胸腺肽α1后DC的活力和对同种T淋巴细胞的增殖作用明显增强，可能的原因就是胸腺肽α1增强了外周血单核细胞的活性和(或)增多了其数量，具体的作用机制有待于进一步研究。文献中尚没有血型对DC刺激同种T淋巴细胞增殖能力有影响的相关报道。

本试验发现胸腺肽α1治疗后高龄老年人DC的体外培养存活时间延长，细胞活力明显上升，培养获得的DC数量明显增多，刺激同种异体T淋巴细胞反应的能力也出现了一定程度的上升。

当今世界人口老龄化是一个发展趋势，并且≥80岁老年人群在老年人群中所占的比例越来越大，≥80岁老年人的免疫功能低下致使感染性疾病的发病率明显增加，已严重影响了他们的生命质量，如何减少感染性疾病的发生率，提高他们的生活质量已成为当今老年病学的一个重要的研究课题。本研究结果为进一步探究老年免疫衰老的发病机制及有效干预提供了一个可靠的实验理论依据。

［1］López-Bravo M，Ardavín C.In vivo induction of immune responses to pathogens by conventional dendritic cells［J］.Immunity，2008，29(3)：343-351.

［2］Wu L，Liu YJ.Development of dendritic-cell lineages［J］.Immunity，2007，26(6)：741-750.

［3］Steinman RM，Banchereau J.Taking dendritic cells into medicine［J］.Nature，2007，449(7161)：419-426.

［4］Sallusto F，Lanzavecchia A.Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factorα［J］.J Exp Med，1994，179(4)：1109-1118.

［5］朱学军，曹雪涛，于益芝，等.人外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，1997，4(4)：302-306.

［6］Yao Q，Doan LX，Zhang R，et al.Thymosin-α1 modulates dendritic cell differentiation and functional maturation from human peripheral blood CD14+monocytes［J］.Immun Lett，2007，110(2)：110-120.

［7］Rasi G，Silecchhia G，Sinabaldi-Vallebona P，et al.Antitumor effect of combined treatment with thymosin alpha 1 and interleukin-2 after 5-fluorouracil in liver metastases from colorectal caner in rats［J］.Int J Cancer，1994，57(5)：701-705.

［8］张兴虎，黄方，万文辉，等.老年人外周血树突状细胞的体外培养及功能研究［J］.实用老年医学，2009，23(4)：270-272.