大肠癌细胞和外周血淋巴细胞对化疗药物的体外敏感性

董米连，杨磊磊，戴岳楚，杨秀英，叶甫波，廖 伟，梅 统

大肠癌细胞和外周血淋巴细胞对化疗药物的体外敏感性

董米连1，杨磊磊1，戴岳楚1，杨秀英1，叶甫波2，廖 伟2，梅 统2

目的：探讨大肠癌细胞及外周血淋巴细胞对化疗药物体外敏感性的及二者的相关性。方法：用MTT法检测40份大肠癌标本及外周血淋巴细胞对氟尿嘧啶（5-FU）、奥沙利铂(L-OHP)、伊立替康(CPT)单药、两药及三药（全量或半量）应用的敏感性。结果：单药最有效的药物依次为伊立替康、奥沙利铂和氟尿嘧啶，敏感率分别为35.0%、27.5%和20.0%；三药联合应用的抑制效果显著优于两药联合(P＜0.05)，三药全量及半量联合应用效果差异无显著性(P＞0.05)；癌细胞及外周血淋巴细胞对3种化疗药物的敏感性有很好的相关性(r=0.969)。结论：MTT可用于为大肠癌患者选择合适的化疗药物，由氟尿嘧啶、奥沙利铂及伊立替康的联合应用具有高效协同抑制大肠癌细胞的作用。

大肠癌细胞；化疗药物；敏感性；淋巴细胞；MTT法

化疗是治疗恶性肿瘤的重要手段之一，大肠癌中、晚期患者术后需辅助化疗。大肠癌普遍存在化疗耐药问题，经验化疗因药缺乏客观依据。为了提高用药的针对性和敏感性，在化疗前进行体外抗肿瘤药敏性测定显得尤为重要[1-2]。利用癌细胞原代培养进行药敏试验，可针对性地指导治疗由于大肠癌对化疗药物敏感性存在的个体差异。本研究用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法[3-(4,5-dimethyl-2-thiazol)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide，MTT法]，对2010年3月—2010年6月40个大肠癌患者的癌细胞及外周血淋巴细胞进行了体外药敏检测。

1 材料和方法

1.1 标本来源 本组共40例，男23例,女17例；年龄18～88岁,中位年龄53岁。经病理证实,均为原发肿瘤,且术前未经放化疗或免疫治疗。其中结肠癌标本12份(腺癌9份,黏液腺癌2份,印戒细胞癌1份),直肠癌28份(腺癌25份,黏液腺癌2份,乳头状管状腺癌1份)。TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期24份,Ⅲ期14份,Ⅳ期2份。同时收集患者的外周血淋巴细胞40份。

1.2 药品与试剂 药品：依据文献报道血浆峰值药物浓度(peak plasma drug concentration，PPC)和预实验结果，确定伊立替康、奥沙利铂基准实验浓度(concentration of benchmark experiments，BTC)分别为12.0 g/mL、10.0 g/mL。联合用药时采用伊立替康终浓度为 12.0 g/mL(全量)和 6.0 g/mL(半量)、奥沙利铂为 10.0 g/mL(全量)和 5.0 g/mL(半量)。

试剂：培养液RPMI-1640（美国Sigma公司）、10%十二烷基硫酸钠（SDS长沙科泰科研试剂有限公司）、胎牛血清（杭州四季青公司）、四甲基氮唑蓝MTT（美国Sigma公司）、胶原酶（美国Sigma公司）、胰蛋白酶（美国Sigma公司）。

1.3 实验仪器 全自动酶标仪statFax2100（美国）、CO2培养箱（FORMA 3111美国）。

1.4 体外药敏试验

1.4.1 大肠癌细胞药敏试验 无菌取新鲜大肠癌手术标本,在含抗生素培养基中浸泡20 min，剪成0.5～1 mm3碎块，置50 mL离心管中,加10 mL含混合消化酶的培养基，37℃消化1 h。200目筛网过滤，获单细胞悬液，用1640培养基洗2次。台盼蓝染色，计活肿瘤细胞数。大肠癌细胞培养于含20%胎牛血清的1640培养基中，以0.25%胰酶消化后制成1×105/mL细胞悬液，于2个96孔板中每孔接种200 μL，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h。于96孔板中加入药物，测定细胞生长。96孔板分为空白组、对照组和药物实验组，药物实验组又分为：(1)单药组，伊立替康全量、奥沙利铂全量、氟脲嘧啶全量；(2)两药联合化疗组，伊立替康全量+奥沙利铂全量、伊立替康全量+氟脲嘧啶、奥沙利铂全量+氟脲嘧啶；(3)三药联合化疗组，伊立替康全量+奥沙利铂全量+氟脲嘧啶、伊立替康半量+奥沙利铂半量+氟脲嘧啶、伊立替康全量+奥沙利铂半量+氟脲嘧啶、伊立替康半量+奥沙利铂全量+氟脲嘧啶)。每组设4个复孔。单药组加入各自浓度药物100 μL；2种药物联合用药时采用1∶1方案，使药物浓缩1倍后各加50 μL，使每孔的药物浓度、体积和总量不变；3种药物联合应用时，采用1∶1∶1方案，使药物浓缩2倍后各加25 μL，再补加25 μL培养基以使药物浓度及总量不变。置于37℃、5%CO2培养箱48 h。每孔加入MTT 20 μL，继续培养4 h。弃培养液，每孔加DMSO 150 μL，充分溶解10 min。全自动酶标仪(测定波长490 nm、参比波长630 nm)测定各孔光密度值(optical density,OD值)，空白组OD＜0.005、实验组OD＞0.1为有效实验。

1.4.2 外周血淋巴细胞药敏试验 取患者外周血10 mL,沿管壁缓慢加至等体积的淋巴细胞分离液的液面上,离心2000 r/min,20 min。轻轻吸取单核淋巴细胞层,置于10 mL离心管中,用PBS溶液洗涤(1500 r/min,5 min)3次,用含有20%胎牛血清的1640培养基悬浮细胞,调整细胞数目至工作浓度。接种培养过程与上述癌细胞操作过程相同。

1.5 数据处理 计算平均抑制率（IR）IR＝[1－（用药组平均OD值－空白组平均OD值）/（对照组平均OD值－空白组平均OD值）]×100%。IR标准采用1978年全国抗癌药物会议制定的《肿瘤药物通用指标》IR＜30%为不敏感，归阴性；30%＜IR＜50%为敏感；IR＞50%为中度敏感，归阳性。

1.6 统计分析 用SPSS 13.0统计软件处理，结果资料采用行乘列的卡方检验及双变量直线相关系数方法分析其相关性，P＜0.05为显著性差异标准。

2 结果

大肠癌原代细胞培养详见图1，患者外周血淋巴细胞培养见图2。不同标本的药物敏感性存在着明显差异，单药中有效性依次为伊立替康、奥沙利铂和氟尿嘧啶，敏感率分别为35.0%、27.5%和20.0%。三药联合应用的抑制效果显著优于两药联合(P＜0.05)，三药全量及半量联合应用效果差异无显著性(P＞0.05)。癌细胞及外周血淋巴细胞对3种化疗药物的敏感性有很好的相关性(r=0.969)。见表1。

图1 大肠癌原代细胞培养

图2 外周血淋巴细胞

表1 大肠癌患者癌细胞与外周血淋巴细胞的药物敏感性比较

3 讨论

MTT法是一种近年来研究较广泛的方法，由Mosman于1983年首创。国内外学者采用MTT法在肿瘤体外药敏试验方面积累了一定的临床和实验资料，认为该法是简便、快捷、经济的药敏方法，临床相关性较高[3-5]。不仅对临床个体化疗有重要指导意义，而且在研究抗癌药物相互作用、耐药修饰剂对细胞毒性的影响、体外新药的筛选以及最终实现个体化疗方面，都有深入研究价值。Tomita等的研究表明，体外药敏试验与体内临床用药不敏感(阴性结果)相符合率均为90%。由此表明，不论是真阳性及真阴性符合率，应用具有简便、快速、敏感、结果可靠等优点的MTT法试验，对于制定临床肿瘤合理化疗策略具有指导意义。

本检测结果显示,不同患者大肠癌标本对化疗药物的敏感程度有明显的异质性。3份未检测到敏感药物及药物组合,4份检测到对所有药物及药物组合均敏感。提示化疗前进行体外药敏检测,可筛选出患者相对敏感的药物,以避免盲目用药的损害。此外,实验显示,大肠癌对单药的敏感性普遍较差,对CPT、L-OHP和5-FU的中度敏感率分别为10.0%、7.5%和2.5%。此结果与大肠癌属化疗低度敏感的临床观察相符合。现在临床上多用2种或2种以上的药物进行联合化疗,但发表的体外药敏试验结果多是单药试验结果,这与临床实际应用有较大距离。因此，我们尝试体外检测临床常用的三种药物氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康单药应用、两药及三药（全量或半量）联合应用的敏感性。结果显示,不同标本的药物敏感性存在着明显差异，单药中最有效的药物依次为伊立替康、奥沙利铂和氟尿嘧啶，敏感率分别为35.0%、27.5%和20.0%。三药联合应用的抑制效果显著优于两药联合(P＜0.05)，三药全量及半量联合应用效果差异无显著性(P＞0.05)。

在本实验中，伊立替康、奥沙利铂及氟脲嘧啶三药联合显示了强大的抗肿瘤活性，明显优于伊立替康或奥沙利铂与氟脲嘧啶的两药联合的效果。Falcone等[5]进行的一项Ⅲ期临床研究表明，应用伊立替康、奥沙利铂及氟脲嘧啶三药联合的FOLFOXIRI方案治疗晚期转移性大肠癌显示出较好的抗肿瘤活性，与伊立替康、氟脲嘧啶二药联合FOLFIRI方案相比在RR、PFS和OS均取得明显的改善。国外也有研究表明，三者联合应用可能通过协同作用而增强抗肿瘤效果。本实验显示，半量与全量的三药联合组内差异不显著，既半量联合可取得全量联合应用相同的效果。这种半量的化疗方案可以在保证疗效的前提下减少毒副作用，为临床应用三药小剂量化疗提供了实验依据。

临床接受化疗的患者，白细胞都有不同程度的降低，这说明化疗药物在抑制肿瘤细胞的同时，也对外周淋巴细胞有一定的抑制作用。肿瘤患者外周血白细胞及血小板是临床化疗过程中的重要参考指标,尤其是白细胞会直接影响化疗药物的选择、化疗疗程的长短，甚至化疗的中止。Kaspers等[6]的研究表明,个体对药物的敏感性与其遗传有关,而外周血淋巴细胞与肿瘤细胞一样具有耐药基因的表达。本实验统计学分析显示,肿瘤细胞与外周血淋巴细胞对3种化疗药物的敏感性有很好的相关性(r=0.969)。外周血淋巴细胞在本实验中可以代替大肠癌细胞进行体外药敏实验。但外周血淋巴细胞在体内与体外的环境变化对药敏实验的影响程度还不清楚，加上我们检测药敏的病例数较少，尚需更多的数据和进一步研究，才能为临床应用提供更有价值的实验依据。因此，只建议对大肠癌病期较晚需要新辅助化疗、病灶较小无法获得足够的癌细胞或癌细胞原代培养失败的大肠癌患者，外周血淋巴细胞可代替癌细胞做MTT体外药敏检测，来指导临床化疗药物的选择。

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Evaluation and Clinical Application of Chemosensitivity of Tumor Cells and Peripheral Blood Lympho⁃ cyte of Patients with Colorectal Carcinoma Determined by MTT Assay in vitro

DONG Mi-lian，YANG Lei-lei,DAI Yue-chu，et al.Taizhou Hospital of Zhejiang Province，Taizhou（317000），China

ObjectiveTo evaluate whether or not the chemosensitivity test of peripheral blood lymphocytes could take place the tumor cells chemosensitivity test in vitro to guide clinical chemotherapy.MethodsThe growth-inhibition effects of irinotecan(CPT),oxaliplatin(L-OHP)and fluorouracil(5-FU),single drug，two or three drugs on 40 human colorectal carcinoma cells and Peripheral blood lymphocyte were observed by MTT assay.ResultsThere were considerable differences in chemo sensitivity between individuals.The most active single drugs in the assay was identified as irinotecan(CPT),oxaliplatin(L-OHP)and fluorouracil(5-FU);35.0%,27.5%and 20.0%of specimens showed sensitivity to them.The growth-inhibition effect of the three drugs combination was significantly enhanced compared with regiment of two drugs combination chemotherapy(P＜0.05)．Further⁃more，whole-dose and half-dose combination of 3 drugs reached similar cell growth inhibitory rate(P＞0.05)；There was no significant difference in the sensitivity of 3 anticancer drugs between PBL and tumor cells of pa⁃tients with colorectal cancer(P＞0.05).ConclusionsThere was the heterogeneity of the in vitro chemosensi⁃tivity in colorectal cancer.The use of the MTT assay provides a method of selecting appropriate anti-cancer drugs in colorectal cancer.The regiment of three drugs in the 5-FU+L-OHP+CPT can synergistically inhibit the proliferation of human colorectal carcinoma cells，which provided reference for the chemotherapy of refractory and recurrent colorectal carcinoma patients．The chemosensitivity test of the peripheral blood lymphocyte may take place of the test of tumor cells for reference to choosing chemotherapeutic drugs in clinical practice.

Colorectal cancer cell；Chemotherapy drugs；Sensitivity；Lymphocytes；MTT assay

R730.53

A

1007-6948(2012)03-0237-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2012.03.006

浙江省医学会临床科研基金项目2009ZYC50;台州市科技计划项目2010-26-48

1.温州医学院附属浙江省台州医院胃肠外科（临海 317000）

2.温州医学院研究生院

董米连，E-mail：dongml@tzhospital.com

（收稿：2011-09-22 修回：2012-05-16）

（责任编辑 刘洪斌）