母胎界面树突状细胞CCL17和CCL22表达在母胎免疫耐受中的作用*

刘玉昆， 刘梅兰， 王蕴慧， 陈 慧， 孟丽丽， 张建平

(中山大学孙逸仙纪念医院妇产科，广东广州510210)

胚胎作为一种半同种移植物，能够不被排斥，有赖于母胎间的免疫耐受，特别是母胎界面免疫微环境的形成和维持，一旦免疫耐受遭到破坏，可能会导致复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)等病理妊娠。树突状细胞(dendritic cells，DC)是一种抗原递呈细胞，近来发现其在免疫耐受中起关键作用，成为免疫耐受机制研究中的热点，其在母胎免疫耐受中的作用也受到广泛关注［1－2］。研究报道非成熟型树突状细胞可以表达CCL17和CCL22，而CD4+CD25+调节性 T细胞(regulatory T cells，Treg)大量表达趋化因子受体CCR4，CCR4与其配体CCL17和CCL22相互作用在CD4+CD25+Treg的分布和募集中起重要作用。那么蜕膜中树突状细胞是否表达CCL17和CCL22?妊娠后蜕膜与妊娠前子宫内膜中树突状细胞CCL17和CCL22的表达是否存在差异?复发性自然流产患者母胎界面CD4+CD25+Treg减少是否与蜕膜树突状细胞CCL17和CCL22的表达异常有关?目前尚无此方面的报道。本研究通过检测非孕期子宫内膜中树突状细胞和正常妊娠早期以及复发性流产患者蜕膜中树突状细胞CCL17和CCL22的表达差异，探讨母胎界面树突状细胞CCL17和CCL22的表达在母胎免疫耐受和复发性自然流产发病中的作用。

材料和方法

1 研究对象

1.1 正常早孕组 选择2008年7月至2009年4月在我院就诊的正常早孕、要求人工流产的妇女24例为正常早孕组(孕周＜10周)，年龄27～37岁，既往无自然流产、死胎、死产史，无染色体畸形、内分泌紊乱、生殖道感染病史，无自身免疫性疾病史。有正常足月分娩1次或以上。本次妊娠期间无腹痛、阴道流血等先兆流产的表现，B超提示胚胎与孕周相符，见心管搏动。

1.2 正常未孕组 选取同期在我院就诊，因子宫肌瘤行腹式子宫切除术患者24例，手术时为月经干净3～7 d，年龄35～42岁，既往有妊娠史，无自然流产、死胎、死产史，均排除自身免疫性疾病史。

1.3 不明原因复发性流产组 选取同期在我院就诊的符合不明原因复发性流产诊断标准(连续3次或3次以上早期自然流产，夫妇染色体正常，排除内分泌、感染因素，无自身免疫性疾病，无子宫畸形)患者24例，就诊时为妊娠早期流产(孕周＜12周)，B超提示胚胎无心管搏动，胚胎绒毛染色体检查正常，年龄27～37岁。3组在纳入研究前3个月均未经任何免疫治疗和接种。

2 蜕膜或子宫内膜单个核细胞的分离、体外DC诱导培养及鉴定

无菌状态下，正常早孕组于人工流产时、复发性流产组清宫时取蜕膜，正常未孕组于腹式子宫切除时取子宫内膜，每次实验所用蜕膜或内膜均取自2个标本，所取标本用Ⅳ型胶原酶/DNA酶Ⅰ消化和密度梯度离心法分离单个核细胞，分离后的单个核细胞用RPMI－1640 完全培养基(含 10%FBS、2 mmol/L L－谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素)悬浮，6孔板贴壁2 h，吸弃未贴壁的细胞，再每孔加入2 mL RPMI－1640完全培养基，并添加细胞因子粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony－stimulating factor，GM －CSF)和IL －4(终浓度均为20 μg/L)，于第3、5、7 d 半量换液，同时加入GM－CSF和IL－4(终浓度均为20 μg/L)，第10 d收集细胞行流式细胞术鉴定细胞及其纯度。

3 3组标本DC CCL17和CCL22 mRNA表达的测定

按上述方法诱导培养DC，于第10 d收集DC。依照Invitrogen公司提供的操作步骤提取总RNA，测定RNA的纯度和浓度符合要求后进行逆转录，合成cDNA，逆转录步骤按照说明书进行(Promega)。然后以β－actin为内参照进行实时荧光定量PCR。CCL17的引物序列为:正义链5＇－GGG AGT GCT GCC TGG AGT AC － 3＇，反义链 5＇－ TAC AAA AAC GAT GGC ATC CCT － 3＇，扩增片段长度 104 bp。CCL22的引物序列为:正义链5＇－TGC CGT GAT TAC GTC CGT TA － 3＇，反义链 5＇－ AAG GTT AGC AAC ACC ACG CC －3＇，扩增片段长度 101 bp。β －actin的引物序列为:正义链5＇－GCA TGG GTC AGA AGG ATT CCT －3＇，反义链 5＇－ TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT－3＇，扩增片段长度106 bp。实时荧光定量PCR的反应体系为:5×SYBR GreenⅠ PCR Buffer 10 μL ，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，Taq 酶(3 × 106U/L)1 μL，cDNA 或阳性标准品 5 μL，ddH2O 31 μL，总体积 50 μL。将装有上述液体的PCR管置于定量PCR仪中，按照如下条件进行实时PCR反应:93℃ 3 min，然后93℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共40循环，72℃ 5 min。扩增完毕后，进入分析界面，以β－actin为内参照，计算各样本的相对定量值。

4 ELISA法检测DC上清液中CCL17和CCL22的蛋白表达

按上述方法诱导培养DC，于第10 d收集DC。再用RPMI－1640完全培养基悬浮，细胞密度为2×105，24 孔板培养，每孔 600 μL，培养 12 h、24 h、48 h、72 h、96 h后收集上清液，期间不换液。收集的上清液，－20℃冻存备用。待样品收集齐后，按Invitrogen公司提供ELISA试剂盒操作步骤检测DC培养上清液中CCL17和CCL22蛋白水平。每次设2个复孔。

5 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。数据用均数±标准差(±s)表示，均数的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 蜕膜或子宫内膜单个核细胞分离、体外DC诱导培养及鉴定

对分离的单个核细胞进行精确计数，每克蜕膜和子宫内膜获得单个核细胞约(1～2)×106个，分离的单个核细胞用6孔板贴壁2 h后见圆形贴壁细胞，经GM－CSF联合IL－4诱导，倒置显微镜观察显示:贴壁细胞形成小的集落，逐渐悬浮，第10 d形成少许突起，以单个悬浮为主，细胞仍呈现小而圆、表面突起少等未成熟DC的形态特征，培养过程中夹杂有少许细长梭状巨噬细胞生长，见图1。第10 d轻轻吸取悬浮细胞，将细胞悬液依照FITC －HLADR和PE－Lin小鼠抗人抗体顺序标记，通过孵育等处理后，流式细胞术检测DC，其纯度＞80%，见图2。

2 3组DC CCL17和CCL22 mRNA的表达

正常早孕组CCL17和CCL22 mRNA水平明显高于正常未孕组和复发性流产组，复发性流产组高于正常未孕组，差异显著(P＜0.01)，见表1。

3 ELISA法分析3组DC上清液中CCL17和CCL22的表达

正常早孕组DC能够持续旺盛分泌趋化因子CCL17和 CCL22，在培养的12～96 h内 CCL17和CCL22的分泌量逐渐增多，48 h累积分泌浓度分别为4 481.20 ng/L 和2 708.71 ng/L，96 h 累积分泌浓度分别为5 162.17 ng/L和3 172.56 ng/L。同一时点早孕组DC分泌的CCL17和CCL22显著高于正常未孕组和复发性流产组，复发性流产组亦高于未孕组(P ＜0.01)，见表2、3。

Figure 1.Dendritic cells(DC)from human decidua or endometria cultured for 10 d(×200).图1 光镜观察树突状细胞

Figure 2.Identification of DC by flow cytometry.图2 树突状细胞流式细胞仪鉴定

表1 蜕膜或子宫内膜DC CCL17和CCL22 mRNA水平表达Table 1.CCL17 and CCL22 mRNA expression in DC from decidua or endometria(±s.n=12)

表1 蜕膜或子宫内膜DC CCL17和CCL22 mRNA水平表达Table 1.CCL17 and CCL22 mRNA expression in DC from decidua or endometria(±s.n=12)

＊＊P ＜ 0.01 vs normal pregnant group;##P ＜ 0.01 vs non －pregnant group.RSA:recurrent spontaneous abortion.

Normal pregnancy 3.04 ±0.40 1.83 ±0.24 Non － pregnancy 0.85 ±0.24＊＊ 0.31 ±0.08＊＊RSA 1.65 ±0.14＊＊## 0.96 ±0.09＊＊##

表2 蜕膜或子宫内膜DC培养不同时间分泌CCL17浓度比较Table 2.Concentration of CCL17 in supernatants of DC in the three groups(ng/L.±s.n=12)

表2 蜕膜或子宫内膜DC培养不同时间分泌CCL17浓度比较Table 2.Concentration of CCL17 in supernatants of DC in the three groups(ng/L.±s.n=12)

＊＊P ＜0.01 vs normal pregnancy group;##P ＜0.01 vs non － pregnancy group.

#

表3 蜕膜或子宫内膜DC培养不同时间分泌CCL22浓度比较Table 3.Concentration of CCL22 in supernatants of DC in the three groups(ng/L.±s.n=12)

表3 蜕膜或子宫内膜DC培养不同时间分泌CCL22浓度比较Table 3.Concentration of CCL22 in supernatants of DC in the three groups(ng/L.±s.n=12)

＊＊P ＜0.01 vs normal pregnancy group;##P ＜0.01 vs non－pregnancy group.

Group 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h Normal pregnancy 2 306.79 ±15.81 2 637.25 ±0.98 2 708.71 ±1.46 3 050.29 ±77.63 3 172.56 ±23.06 Non －pregnancy 92.41 ±8.70＊＊ 100.99 ±10.35＊＊ 118.91 ±2.40＊＊ 126.20 ±1.49＊＊ 130.00 ±12.50＊＊RSA 440.76 ±3.42＊＊## 495.17 ±3.69＊＊## 514.65 ±2.34＊＊## 510.52 ±8.82＊＊## 509.20 ±3.87＊＊##

讨 论

1 蜕膜树突状细胞的分离与纯化

获得足够数量及纯度的子宫局部树突状细胞，尽可能模拟体内情况，是研究树突状细胞在母胎免疫耐受中作用或妊娠免疫相关疾病的基础。但妊娠时蜕膜DC占蜕膜细胞总数的1%［3］，极大地限制了DC的研究和应用。既往应用体外组织培养和磁珠或流式细胞仪分选DC，由于前者分离纯度低，后者程序复杂且消耗大量抗体，均不能快速简便地获取DC。本研究采用蜕膜、子宫内膜单核细胞体外经GM－CSF和IL－4联合诱导培养DC。该法利用单核细胞具有短暂贴壁特性将其分离出，单核细胞也是DC前体，可以分化发育为DC［4］。GM－CSF和IL－4是诱导DC所必需细胞因子。GM－CSF促进DC生长发育，IL－4抑制培养体系中的中性粒细胞和巨噬细胞的生成，并维持DC处于未成熟状态，TNF－α则促进DC的成熟。由于本实验欲了解原代单核细胞诱导的DC分泌CCL17和CCL22的能力，因而未在原代培养第7 d加入TNF－α人为促DC成熟。本研究于第10天收集细胞，所得到的 DC能满足后续实验的需求，便于相关课题研究的深入开展。

2 树突状细胞在母胎免疫耐受中起重要作用

树突状细胞是目前发现的功能最强大的专职性抗原递呈细胞，以其细胞表面伸出许多突起为形态特点，能将外周组织中捕获的抗原加工处理后传递给次级淋巴组织中的抗原特异性T细胞，使其活化增殖并引起抗原特异性免疫反应。但在某些情况下，树突状细胞接受抗原刺激后，仍处于非成熟状态，这种非成熟树突状细胞非但不能引起童真T细胞活化，反而可使活化T细胞去能，最终导致免疫耐受［5］。树突状细胞能够诱导免疫耐受的发现，使其在移植免疫、自身免疫疾病领域成为研究的热点。近来树突状细胞在母胎免疫耐受中的作用也引起人们的关注［1－2］。

Gardner等［6］和 Kammerer等［7］对人蜕膜中树突状细胞的表型和分布进行研究，发现早孕期蜕膜中存在HLADR+lin－的非成熟型树突状细胞，免疫组化显示树突状细胞散在分布在蜕膜中，在种植部位可见其与滋养细胞很接近。将蜕膜树突状细胞分离，发现其能够吞噬抗原，但却不能刺激幼稚T细胞。Blois等［8］对孕鼠子宫局部及外周血中的树突状细胞在孕期的变化进行研究，发现树突状细胞在孕5.5 d开始上升，8.5 d 达高峰，9.5 ～17.5 d 为平台期。在子宫局部只有＜30%的树突状细胞表达MHCⅡ类分子，表明大部分树突状细胞处于非成熟状态，并且在孕5.5～8.5 d，MHCⅡ类分子的表达明显下降。Plaks等［9］应用基因敲除技术在胚胎种植期清除孕鼠子宫局部的树突状细胞，结果导致蜕膜化失败和流产，可见树突状细胞在妊娠种植中起重要作用。

3 妊娠期蜕膜树突状细胞CCL17和CCL22表达增加的意义

树突状细胞分泌的趋化因子在局部炎症免疫和肿瘤免疫中T细胞的募集过程中起重要作用，且随着树突状细胞成熟状态的不同，分泌的趋化因子呈动态变化，从而使其所募集的淋巴细胞不同［10－11］。具有免疫耐受作用的DC可以表达CCL17和CCL22［12］。本研究发现，子宫局部内膜或蜕膜DC能表达CCL17和 CCL22，正常妊娠后蜕膜 DC表达CCL17和CCL22不管在mRNA水平还是蛋白水平上均显著高于正常未孕者。CCL17和CCL22是CD4+CD25+Treg的趋化因子，CD4+CD25+Treg上表达CCL17和CCL22的受体CCR4。体外实验发现 DC可通过分泌CCL17和CCL22引导CD4+CD25+Treg游走［13］。CCL17和 CCL22在 CD4+CD25+Treg的分布、募集中起重要作用。Kang等［14］应用基因沉默技术降低树突状细胞CCL17和CCL22的表达可明显减少局部CD4+CD25+Treg的募集。妊娠后体内激素发生很大变化，雌激素、孕激素、绒毛膜促性腺激素等显著增多，已有研究发现，孕激素可诱导蜕膜树突状细胞分化为具有免疫耐受功能的未成熟型树突状细胞［15］。推测蜕膜中未成熟树突状细胞的增多使其表达CCL17和CCL22增加，从而可以募集更多的CD4+CD25+Treg到母胎界面。CD4+CD25+Treg能够限制效应性T细胞或清除抗原特异性T细胞，众多研究已证实其在母胎免疫耐受中的重要作用［16－17］，而复发性流产患者母胎界面 CD4+CD25+Treg较正常妊娠者明显减少［18］。本研究中复发性流产患者蜕膜树突状细胞CCL17和CCL22的表达明显低于正常妊娠者，推测树突状细胞CCL17和CCL22的表达下降可导致募集到母胎界面的CD4+CD25+Treg减少，从而引起母胎免疫耐受的破坏，导致复发性流产等病理妊娠。

［1］Pollard JW.Uterine DCs are essential for pregnancy［J］.J Clin Invest，2008，118(12):3832 －3835.

［2］Blois SM，Kammerer U，Alba Soto C，et al.Dendritic cells:key to fetal tolerance?［J］.Biol Reprod，2007，77(4):590－598.

［3］Banchereau J，Briere F，Caux C，et al.Immunobiology of dendritic cells［J］.Annu Rev lmmunol，2000，18:767 －811.

［4］Liu YJ.Dendritic cell subsets and lineages，and their functions in innate and adaptive immunity［J］.Cell，2001，106(3):259－262.

［5］Shortman K，Heath WR.Immunity or tolerance?That is the question for dendritic cells［J］.NatImmunol，2001，2(11):988－989.

［6］Gardner L，Moffett A.Dendritic cells in the human decidua［J］.Biol Reprod，2003，69(4):1438 －1446.

［7］Kammerer U，Eggert AO，Kapp M，et al.Unique appearance of proliferating antigen－presenting cells expressing DC－SIGN(CD209)in the decidua of early human pregnancy［J］.Am J Pathol，2003，162(3):887 －896.

［8］Blois SM，Alba Soto CD，Tometten M，et al.Lineage，maturity，and phenotype of uterine murine dendric cells through gestation indicate a protective role in maintaining pregnancy［J］.Biol Reprod，2004，70(4):1018 －1023.

［9］Plaks V，Birnberg T，Berkutzki T，et al.Uterine DCs are crusial for decidua formation during embryo implantation in mice［J］.J Clin Invest，2008，118(12):3954 －3965.

［10］Muthuswamy R，Urban J，Lee JJ，et al.Ability of mature dendritic cells to interact with regulatory T cells is imprinted during maturation［J］.Cancer Res，2008，68(14):5972－5978.

［11］Beaty SR，Rose CE Jr，Sung SS.Diverse and potent chemokine production by lung CD11bhighdendritic cells in homeostasis and in allergic lung inflammation［J］.J Immunol，2007，178(3):1882 －1895.

［12］Yogo Y，Fujishima S，Inoue T，et al.Macrophage derived chemokine(CCL22)，thymus and activation－regulated chemokine(CCL17)，and CCR4 in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Respir Res，2009，10(1):80.

［13］Valmori D，Liénard D，Waanders G，et al.Analysis of MAGE－3－specific cytolytic T lymphocytes in human leukocyte antigen － A2 melanoma patients［J］.Cancer Res，1997，57(4):735 －741.

［14］Kang S，Xie J，Ma S，et al.Targeted knock down of CCL22 and CCL17 by siRNA during DC differentiation and maturation affects the recruitment of T subsets［J］.Immunobiology，2010，215(2):153 －162.

［15］沈 媛，曾耀英，肇静娴.孕酮对人树突状细胞成熟和免疫功能的影响［J］.中国病理生理杂志，2008，24(6):1143－1147.

［16］黄立峰，姚咏明，盛志勇.树突状细胞与调节性T细胞［J］.中国病理生理杂志，2008，24(3):610 －616.

［17］Saito S，Sasaki Y，Sakai M.CD4+CD25highregulatory T cells in human pregnancy［J］.J Reprod Immunol，2005，65(2):111－120.

［18］Mei S，Tan J，Chen H，et al.Changes of CD4+CD25highregulatory T cells and FOXP3 expression in unexplained recurrent spontaneous abortion patients［J］.Fertil Steril，2010，94(6):2244 －2247.