针刺对创伤性脑损伤大鼠脑组织EGF和bFGF表达的影响*

张毅敏， 唐纯志， 程少冰， 陈爱连， 张玉卿

(1暨南大学医学院中医系，广东广州510632;2广州中医药大学针灸推拿学院，广东广州510010)

创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是一个世界性的社会医学问题，发生率为1‰［1－2］，已成为发达国家青少年伤病致死的首位病因。目前利用神经干细胞修复颅脑损伤已成为国内外生物及医学研究的热点［3］。内源性神经干细胞具有来源稳定可靠、无伦理道德问题、无免疫排斥反应、无致瘤性等优势，因此，寻找积极干预措施，充分调动内源性神经干细胞治疗神经系统疾病已成为当前新的研究热点［4］。神经干细胞的增殖分化受多种生长因子的调控，其中表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是对神经干细胞的生长和增殖起关键作用的生长因子。大量临床资料表明，针刺对脑损伤患者催醒及神经功能恢复有显著疗效［5］，故本研究采用脑挫伤大鼠动物模型，观察针刺对脑损伤后相关生长因子EGF和bFGF的影响，探讨针刺促进神经再生、治疗脑损伤的可能作用机制。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠共30只，体重(280±30)g，鼠龄42 d，由广州中医药大学动物实验中心提供，动物合格证号为0067955。本实验在广州中医药大学清洁级动物实验室完成。

1.2 试剂与药物 EGF和bFGF免疫组化检测试剂盒(德国宝灵曼公司产品，购自武汉博士德生物工程有限公司)。针具为“华佗牌”一次性26号、1寸针灸针。

1.3 仪器 RM2025切片机(Leica)和EG1140H包埋机。Olympus BX50F－3双目显微镜(附件自动照相装置Nikon E990)。计算机图像分析系统(GM－2000B生物医学图像分析系统，北京航天航空大学产品)。

2 方法

2.1 脑损伤模型建立 动物随机分为3组:A组为假手术组，B组为模型组，C组为针刺组，每组10只。大鼠称重后腹腔注射10 g/L戊巴比妥钠(30 mg/kg)，麻醉成功后参照Feeney自由落体冲击造模法［6］，沿颅骨正中线纵形切开头皮，分离至颅骨，于矢状缝左旁2 mm，冠状缝后2 mm处，用牙科钻钻开颅骨，以此为中心，用蚊式血管钳咬开直径约4 mm圆形骨窗，深度至硬脑膜，保持硬脑膜完整。B、C组用致伤力度为25 g小锤从25 cm高度自由落下，打击置于硬脑膜上的直径为3 mm的圆柱体，造成左顶叶大脑皮质局限性脑挫裂伤，然后将动物缝合头皮。A组钻孔后不打击，直接缝合头皮。

针刺组造模后24 h内开始治疗。针刺组穴位:百会、人中、风府透哑门和合谷。将针刺入穴位2 mm，采用捻转平补平泻手法，每穴操作2 min。每天治疗1次，共治疗7次。假手术组及模型组不做治疗。各组在相同条件下喂养。治疗结束当天取材，大鼠用10%的水合氯醛麻醉，断头取脑，4%中性多聚甲醛液固定，常规脱水，石蜡包埋，沿挫伤灶中心作冠状切片，片厚4 μm。

2.2 免疫组化法检测EGF和bFGF 各组实验大鼠脑组织切片经纯二甲苯脱蜡2次，每次6 min;梯度乙醇脱二甲苯各2 min;自来水漂洗、PBS漂洗各3次，每次2 min，加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，室温下作用10 min;切片放入已沸腾的柠檬酸修复液中，继续加热至溶液冒小气泡但不沸腾为度，保持10 min;停止加热，冷却至室温约25 min，流水冲洗，PBS液洗2次，擦干切片组织周围表面水分划隔离圈;加入5%BSA封闭液，室温下作用20 min;吸去血清，不洗分别直接滴加入对应的(浓度1∶100)稀释的第Ⅰ抗体兔抗(EGF、bFGF)100 μL/片，取1张切片滴加PBS作为阴性对照，37℃恒温箱内1 h;PBS冲洗，3 min×3次，滴加羊抗兔生物素化Ⅱ抗，100 μL/片37 ℃恒温箱内 20 min;PBS冲洗，3 min×3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲合素100 μL/片，37℃恒温箱内20 min;PBS洗后滴加入DAB显色液100 μL/片，显色3～5 min;苏木素浅复染，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、分析结果。注意:操作过程中组织必须保持在湿润状态，不能干燥;所加试剂以完全覆盖组织为度。

免疫组织化学染色结果判断:由病理专科医生在未知实验分组情况下对所有标本进行分析。在10×20倍光镜下随机观察每一组动物同一部位切片，每张切片选择5个不重复视野进行观察，并采用全自动图像分析系统测出每张切片内脑组织EGF和bFGF的染色平均吸光度和染色面积率。阳性物质在胞浆(膜上)内呈棕黄色细颗粒状，细胞核为浅蓝色;阴性对照仅细胞核为浅蓝色。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析。组间比较:方差齐性时采用LSD检验，方差不齐时采用T3法检验。数据以均数±标准差(±s)表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 针刺对脑挫伤大鼠脑组织EGF表达的影响

模型组大鼠EGF平均吸光度值与阳性面积率较假手术组明显降低(P＜0.01);针刺组EGF平均吸光度值与阳性面积率较模型组明显升高(P＜0.01)，见图1、表1。

2 针刺对脑挫伤大鼠脑组织bFGF表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠bFGF平均吸光度值升高((P＜0.01)，但阳性面积率无显著差异(P ＞0.05);与模型组比较，针刺组bFGF平均吸光度值和阳性面积率均明显升高(P ＜0.01)，见图2、表2。

Figure 1.Expression of EGF protein in the cerebral cortex of rats in different groups(SABC staining，×200).A:sham －operated group;B:model group;C:acupuncture group.图1 各组大鼠大脑皮质EGF蛋白表达

表1 针刺对脑损伤大鼠脑组织EGF表达的影响Table 1.Effect of acupuncture on EGF expression in brain tissues of rats with traumatic brain injury(±s.n=10)

表1 针刺对脑损伤大鼠脑组织EGF表达的影响Table 1.Effect of acupuncture on EGF expression in brain tissues of rats with traumatic brain injury(±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs sham － operated group;▲▲P ＜0.01 vs model group.

Group Absorbance Rate of positive area Sham － operated 0.69 ±0.05 0.43 ±0.03 Model 0.34 ±0.31＊＊ 0.18 ±0.16＊＊Acupuncture 0.53 ±0.36＊＊▲▲ 0.29 ±0.22＊＊▲▲

表2 针刺对脑损伤大鼠脑组织bFGF表达的影响Table 2.Effect of acupuncture on bFGF expression in brain tissues of rats with traumatic brain injury(±s.n=10)

表2 针刺对脑损伤大鼠脑组织bFGF表达的影响Table 2.Effect of acupuncture on bFGF expression in brain tissues of rats with traumatic brain injury(±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs sham － operated group;▲▲P ＜0.01 vs model group.

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Figure 2.Expression of bFGF protein in the cerebral cortex of rats in different groups(SABC staining，×200).A:sham －operated group;B:model group;C:acupuncture group.图2 各组大鼠大脑皮质bFGF蛋白表达

讨 论

神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的增殖分化受多种生长因子的调控［7］，目前普遍认为EGF和bFGF等丝裂原信号在NSCs的生长和增殖起关键作用，均可维持NSCs的自我更新能力，其它细胞因子起协同作用［8］。bFGF是能够促进NSCs或神经前体细胞有丝分裂并具有神经营养作用的活性多肽，除通过FGFR－1传递有丝分裂信号外还通过其它受体起作用［9］。体外研究表明:EGF和 bFGF可以使NSCs在体外呈神经球样生长，并促进细胞分化，使未分化的神经细胞向着生成神经元的方向分化。但EGF与bFGF在NSCs增殖和分化中的作用存在一定差异:bFGF在胚胎发育早期具有维持神经前体细胞生存和促进其增殖的作用，而EGF在发育晚期能促进神经前体细胞增殖和分化;FGF－2主要促使向神经元转化，而EGF诱导NSCs分化为胶质细胞［10］。研究者在EGF灌注后立即检测扩增细胞群的特征，发现95%以上的细胞呈EGF受体阳性和神经上皮干细胞蛋白(nestin)阳性。停止EGF注射7周后，一部分细胞分化成为新的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞［11］。正常脑组织有基础性bFGF表达，脑损伤后bFGF表达水平上调。Neary等［12］研究发现，bFGFmRNA表达在24 h时增强，3 d时达高峰，并持续到7 d。也有研究发现，三七总皂苷能促进脑内bFGF合成及分泌，刺激神经干细胞的增殖，使缺血再灌注大鼠的nestin表达上调，从而发挥脑保护作用［13］。

本研究结果显示，模型组损伤区脑组织EGF平均吸光度与阳性面积率均明显降低，而bFGF平均吸光度值升高，这与以往的研究结果一致［12］，表明造模是成功的。针刺组EGF、bFGF均较模型组明显升高(P＜0.01)，表明针刺能上调神经再生相关生长因子EGF和bFGF的表达，加速损伤脑组织修复。我们的前期研究结论“针刺可促进神经干细胞的增殖与分化”及“针刺可缩小脑损伤面积”均证明了这一点［14］。

综上所述，针刺可促进神经再生相关生长因子EGF和bFGF的表达，这可能是针刺促进神经再生和功能恢复、治疗颅脑损伤的机制之一。

［1］王 慧，李 波，潘承光，等.创伤性颅脑损伤脑脊液代谢谱改变及临床意义［J］.现代生物医学进展，2010，10(4):668 －670.

［2］赵鹏飞，王守森，王如密.颅脑损伤致伤原因研究现状［J］.中国临床神经外科杂志，2009，14(4):248 －250.

［3］李明军，张琦玮，王维峰，等.神经干细胞的应用［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，12(29):5709－5714.

［4］黄艳君.成体内源性神经干细胞的激活及活化策略［J］.中国康复医学杂志，2007，22(4):380－382.

［5］张毅敏.针灸治疗颅脑损伤及其后遗症的概况［J］.中国临床康复，2006，10(7):135－137.

［6］田贵华，谭 纯，姚海江，等.针刺对大鼠颅脑损伤后轴突导向因子Slit2表达的影响［J］.中华中医药杂志，2011，26(5):1197－1200.

［7］胡 越，蒋 莉.神经干细胞与内源性神经再生的研究进展［J］.重庆医学，2005，34(2):220 －222.

［8］王 娜，刘蜆星，连易水，等.神经干细胞研究进展［J］.生物学杂志，2009，26(1):55 －58.

［9］黄河清，陈康宁.营养因子调控脑缺血后内源性神经干细胞发生的研究进展［J］.现代生物医学进展，2009，9(2):379－384.

［10］Gritti A，Vescovi AL，Galli R.Adult neural stem cells:plasticity and developmental potential［J］.J Physiol Paris，2002，96(1 －2):81 －90.

［11］Sottile V，Li M，Scotting PJ.Stem cell marker expression in the Bergmann glia population of the adult mouse brain［J］.Brain Res，2006，1099(1):8 －17.

［12］Neary JT，Kang Y，Shi YF，et al.Signaling from nucleotide receptors to protein kinase cusades in astrocytes［J］.Neurochem Res，2004，29(11):2037－2042.

［13］程 龙，朱培纯，司银楚，等.三七总皂甙对去大脑皮层血管后成年大鼠前脑侧脑室室管膜下层nestin和bFGF表达的作用［J］.北京中医药大学学报，2003，26(3):18－20.

［14］张毅敏，唐纯志，程少冰，等.针刺对脑挫伤大鼠脑组织坏死面积及脑细胞凋亡的影响［J］.中医杂志，2010，51(6):528－530.