干扰素诱导蛋白p204对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制*

龙向淑， 吴 强， 宋 方

(贵州省人民医院心血管内科，贵州贵阳550002)

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是构成血管壁的重要成分，其增殖和凋亡失衡是动脉粥样硬化、高血压以及冠状动脉介入治疗术后再狭窄等血管增殖性疾病发病的主要病理生理机制。干扰素诱导蛋白p204(interferon－inducible protein p204)是干扰素(interferon，IFN)诱导蛋白p200家族(interferon－inducible protein 200 family，p200，IFI200)鼠类蛋白成员，其编码基因Ifi204由Lengyel等［1］首先发现并成功克隆，其 mRNA约为2.2～2.3 kb，基因产物含640个氨基酸残基，表观分子量约72 kD。已有研究［2－4］表明，p204 可通过不同机制抑制多种细胞的增殖;且最近的研究显示，p204可抑制大鼠VSMCs的增殖，p21可能参与了p204影响VSMCs增殖的下游调控［5］。生长因子在不同细胞通过不同的信号通路影响细胞增殖。本研究旨在进一步探讨p204在抑制大鼠VSMCs增殖的过程中与相关细胞增殖信号通路之间可能存在的关系。

材料和方法

1 大鼠VSMCs的培养和实验分组

纯种SD大鼠(雌雄不拘)3只(购自第三军医大学实验动物中心)，体重 120 ～140 g，按文献［6］介绍的方法进行胸主动脉平滑肌细胞的培养、纯化及鉴定。细胞培养及鉴定所用主要试剂DMEM高糖型细胞培养液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自HyClone;α－SMA单克隆抗体(BM0002)、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒为武汉博士德公司产品。取4－6代细胞用于实验。实验分为4组，即空白阴性对照组(negative group，N)、非特异性 siRNA组(control siRNA group，C)、IFN － α 诱导组(IFN－ α induction group，IFN)和 Ifi204 siRNA转染组(Ifi204 siRNA transfection group，siRNA)。干预所用药物IFN－α购自北京三元基因工程有限公司。转染试剂control siRNA －A(sc－36869)购自Santa Cruz;Ifi204 siRNA由宝生物工程(大连)有限公司合成，见表1;LipofectamineTM2000 reagent购自Invitrogen。各组干预6 h，继续培养48 h收集细胞。

表1 siRNA及引物序列Table 1.The sequences of primers and siRNA

2 实时qRT－PCR法检测mRNA表达

按TRNzol总RNA提取试剂盒(购自北京天根公司)说明操作提取细胞总RNA，按RT－PCR两步法试剂盒(DRR047A，购自TaKaRa)说明书逆转录合成cDNA，然后按DRR420A试剂盒(购自TaKaRa)说明书操作进行实时qRT－PCR扩增。PCR扩增引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，见表1。按2－ΔΔCt法计算 p204 mRNA 的表达量。

3 Western blotting检测蛋白表达

按文献［7］介绍的方法进行蛋白样品的制备、定量、分离、转膜、印迹，从而测定特定蛋白的相对含量。使用的主要试剂p204抗体(sc－13367)购自Santa Cruz;Tubulin抗体(AT819)购自碧云天;Ras(ab108602)、p－Raf(ab78334)、p－ERK 44/42(ab47339)、p－Akt(ab78403)和 p－p38(ab32557)均购自Abcam。

4 MTT检测细胞活力

收集对数生长期细胞，按3 000 cells/well接种于96孔板，各组干预方法同上述实验。培养板用平板离心机4 000 r/min离心5 min，充分吸尽上清。每孔加入150 μL DMSO，置旋转摇床上低速振荡10 min，酶联免疫仪490 nm波长检测各孔吸光度A值。涉及的主要试剂四甲基偶氮唑盐［3－(4，5－dimethylthiazol－2－yl)－2，5 －diphenyltetrazolium bromide，MTT］购自 Sigma。

5 流式细胞术检测细胞周期

按细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(C1052，购自碧云天公司)说明书操作收集细胞、染色后采用配套软件进行细胞DNA含量分析。

6 统计学处理

结 果

1 p204在VSMCs的基础表达和干预因素的影响

实时qRT－PCR和 Western blotting显示，p204在N组存在一定丰度的基础表达。与N组比较，IFN组的p204 mRNA与蛋白表达上调(P＜0.05)，siRNA组的p204 mRNA与蛋白表达下调(P＜0.05)，而C组与N组相比无显著差异，见图1～3及表2。

Figure 1.The curves of amplification and melting of p204 and GAPDH in real－time qRT－PCR.图1 p204和GAPDH real－time qRT－PCR扩增曲线和熔解曲线

2 p204表达对VSMCs增殖的影响

与N组比较，IFN组 MTT的 A值降低(P＜0.05);G0/G1期细胞增多，S期细胞减少(P＜0.05);siRNA组MTT的A值增高(P＜0.05)，G0/G1期细胞减少，S期细胞增多(P＜0.05);而C组与N组的上述指标间差异无统计学意义，见表3。

3 p204表达对相关细胞增殖信号通路的影响

与N组比较，IFN组Ras蛋白表达和Raf及ERK的磷酸化水平下调(P＜0.05)，siRNA组Ras蛋白表达和Raf及ERK的磷酸化水平上调(P＜0.05)，而C组与N组的上述指标间差异无统计学意义，见图2。4组间的p38 MAPK或Akt磷酸化水平的差异无统计学意义，见图3。

表2 干预因素对p204 mRNA表达的影响Table 2.Effects of intervention factors on p204 mRNA expression(±s.n=3)

表2 干预因素对p204 mRNA表达的影响Table 2.Effects of intervention factors on p204 mRNA expression(±s.n=3)

N:negative group;C:control siRNA group;IFN:IFN－α induction group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.*P ＜0.05 vs negative group.

Group Ct ΔCt 2 －ΔΔCt p204 GAPDH N 19.15 ±0.23 16.78 ±0.36 2.37 1.00 C 19.33 ±0.56 16.83 ±0.26 2.50 0.91 IFN 17.22 ±0.38 17.08 ±0.09 0.14 4.69*siRNA 20.99 ±0.22 16.95 ±0.21 4.04 0.31*

表3 p204表达变化对VSMCs增殖及细胞周期的影响Table 3.Effects of p204 expression variation on cell cycle and proliferation of VSMCs(±s.n=3)

表3 p204表达变化对VSMCs增殖及细胞周期的影响Table 3.Effects of p204 expression variation on cell cycle and proliferation of VSMCs(±s.n=3)

N:negative group;C:control siRNA group;IFN:IFN－α induction group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.*P＜0.05 vs negative group.

N*

Figure 2.Effects of p204 expression variation on Ras/Raf/ERK signal pathway.±s.n=3.*P＜0.05 vs negative group.N:negative group;C:control siRNA group;IFN:IFN－α induction group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.图2 p204表达变化对Ras/Raf/ERK信号通路的影响

Figure 3.Effects of p204 expression variation on phosphorylation of p38 and Akt.±s.n=3.*P＜0.05 vs negative group of p204 protein.N:negative group;C:control siRNA group;IFN:IFN－α induction group;siRNA:Ifi204 siRNA transfection group.图3 p204表达变化对p38及Akt磷酸化水平的影响

讨 论

VSMCs过度增殖是血管增殖性疾病发病的主要环节，因此，研究如何采取有效措施抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移以及表型转化等是血管增殖性疾病领域研究的热点。

IFN是一组具有抗病毒、抗增殖、影响细胞生长和分化、调节免疫应答等众多生物学功能的活性细胞因子家族［8］。IFN与相应受体结合诱导一系列效应分子的产生而发挥其抗病毒、影响细胞增殖等作用［9］。p204是IFN诱导蛋白p200家族蛋白的鼠类成员。分子结构上，p204氨基端起始部含有一个由88个氨基酸残基构成的DAPIN结构域，在其羧基端含有两个相连的200A和200B。p204通过其特定的结构域介导IFN应答及与凋亡和炎症信号通路蛋白(如 p53、pRb 和 Ras等)之间的结合［1］，发挥其调节细胞增殖、分化及迁移等生物学功能。本研究结果显示，诱导p204 mRNA和蛋白表达增多，VSMCs增殖受到抑制，G0/G1期细胞增多，S期细胞减少;相反，抑制p204 mRNA和蛋白表达后，VSMCs增殖明显，G0/G1期细胞减少，S期细胞增多。表明p204蛋白具有抑制VSMCs增殖及细胞周期G1/S转换的作用。

细胞增殖是细胞外刺激信号作用于细胞膜或胞质受体，经细胞内信号传递使细胞周期改变为主的综合性细胞行为，细胞内信号传递过程就成为细胞能否增殖的关键。丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)家族是细胞内信号蛋白网络中重要的一员，主要介导细胞的发生、分化、增殖、凋亡及细胞间的功能同步等多种生理过程。目前至少鉴定出4种MAPK家族成员，分别为细胞外信号调节激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)、c－Jun N端激酶/应激活化蛋白激酶、p38 MAPK 及 ERK5［10］。Ras和 Raf为 ERK 活化的上游信号蛋白，Ras在细胞外信号刺激下，转化为激活型Ras，激活型Ras磷酸化活化Raf，活化的Raf再激活MEK，MEK经磷酸化最终激活 ERK，活化的ERK入核，启动相应转录子的转录。Akt又称蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分子量约60 kD，Akt的活化亦可影响细胞的增殖、凋亡及衰老等生物学功能。p204可通过其200X结构域中的保守模序MF/LHATVAT/S与p53蛋白直接结合，调节p53介导的转录调控是其抑制细胞增殖的主要机制之一。p53可在转录水平促进p21表达，亦可抑制ras基因及myc基因协同作用引起的细胞增殖［11］。本研究结果显示，诱导p204蛋白表达上调，抑制VSMCs增殖的同时，Ras蛋白表达减少，其下游信号蛋白Raf和ERK磷酸化水平亦随之下降;反之，通过RNA干扰抑制p204表达，促进VSMCs增殖，则伴随Ras蛋白表达增多，Ras信号通路下游信号蛋白Raf和ERK磷酸化水平亦升高。然而在上述过程中，对细胞增殖亦有重要影响的信号通路p38 MAPK及PI3K/Akt在VSMCs的磷酸化水平却未出现明显变化。故认为p204可能通过Ras/Raf/MEK/ERK信号通路抑制VSMCs的增殖，而与p38 MAPK和PI3K/Akt信号通路无关。

［1］宋 方，吴 强.干扰素诱导蛋白p204调节心肌分化的机制及应用前景［J］.中国细胞生物学学报，2011，33(1):59－64.

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［5］龙向淑，吴 强，宋 方.干扰素诱导蛋白p204表达变化对大鼠血管平滑肌细胞增殖及p21表达的影响［J］.中国病理生理杂志，2012，28(2):249－252.

［6］宋 方，吴 强，陆德琴，等.一套系统培养鼠主动脉血管壁细胞简单可靠的方法［J］.中国动脉硬化杂志，2011，19(4):361－366.

［7］药立波，常智杰，马文丽，等.医学分子生物学实验技术［M］.第1版.北京:人民卫生出版社，2002.33－52.

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