大鼠胶原诱导性关节炎关节滑膜Treg/Th17平衡及TNF－α拮抗剂的影响*

陈瑞林， 陶 怡， 黄文辉， 吕志芬， 李 娟

(1南方医科大学附属南方医院风湿科，广东广州510515;2广州医学院第二附属医院风湿科，广东广州510260)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节软骨和骨破坏为特征的慢性炎症性自身免疫病［1］。这种破坏性损伤是由免疫反应和抗原非特异性炎症过程引起的。RA的病因及发病机制尚不完全清楚，T细胞亚群异常在RA发病机制中起重要作用［2］。越来越多的证据表明，调节性T细胞(regulatory T-cells，Treg cells)和Th17细胞分化失衡可能在RA发病中占有重要地位［3］。但现有的大部分研究多关注RA外周血T细胞亚群失衡状态，对于关节滑膜内Treg/Th17平衡，则很少报道。

本研究通过建立胶原诱导性关节炎(collageninduced arthritis，CIA)大鼠模型，研究Treg/Th17平衡在关节滑膜病变发生发展中的作用，并应用肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)拮抗剂肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFR-Fc)治疗，探讨TNFR-Fc对CIA关节滑膜Treg/Th17平衡的影响，以进一步阐明TNF-α拮抗剂治疗的作用机制，并为更好地理解RA的发病机制、寻找更好的治疗靶点提供理论依据。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 健康SPF级雌性Lewis大鼠30只，体重140～160 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要试剂 TNFR-Fc(由浙江海正药业提供)，牛源性Ⅱ型胶原(Chondrex)，不完全弗氏佐剂(Chondrex)，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA 试剂盒(R＆D)，兔抗大鼠 CD4多克隆抗体(Abbiotec)，大鼠叉头框P3蛋白(forkhead box P3 protein，Foxp3)单克隆抗体(Biolegend)，大鼠转录因子维甲酸受体相关孤儿受体γt(retinoic acid receptor-related orphan receptor γt，RORγt)单克隆抗体(Abcam)，FITC结合的抗兔IgG和rhodamine结合的抗鼠IgG(Sigma)。

2 方法

2.1 CIA大鼠模型的建立 按文献［4］报道的建立CIA大鼠模型，简述如下:将30只Lewis大鼠随机分成正常对照组、CIA组、TNFR-Fc治疗组。将牛源性Ⅱ型胶原和等体积不完全弗氏佐剂混合、乳化后，CIA组和TNFR-Fc治疗组大鼠于尾根部及背部多点皮下注射0.4 mL，正常对照组大鼠皮下注射等量生理盐水。7 d后加强免疫，第13 d TNFR-Fc治疗组开始采用10 mg/kg TNFR-Fc腹腔注射，隔天1次;CIA组则予等量生理盐水腹腔注射，隔天1次。

2.2 模型的鉴定及评估

2.2.1 关节炎的分级评估 每周1次评估大鼠关节肿胀和红斑的出现情况。根据Wood法对关节炎的严重程度进行分级评估，评定依据为关节红肿程度和范围以及关节肿大和变性情况。0:正常;1:红肿;2:肿胀;3:足趾畸形;4:踝部畸形，不能负重。每侧关节最高4分，每只大鼠最高评分为16分。关节炎指数(arthritis index，AI)=四肢关节评分之和。

2.2.2 关节滑膜组织病理形态学检查 造模后35 d处死大鼠，取后踝关节，置于10%甲醛溶液中固定24 h，经脱钙、脱水、透明、包埋等处理制成石蜡块，室温保存。切片，甲苯胺蓝、HE染色，光学显微镜下观察病理组织学变化。

2.2.3 血浆TNF-α浓度检测 心脏穿刺法取大鼠外周血2 mL，置于EDTA抗凝管中，离心，取上层血浆，-80℃保存;大鼠TNF-α ELISA试剂盒检测各组大鼠血浆TNF-α浓度，操作步骤按说明书进行。

2.3 滑膜Foxp3和RORγt蛋白表达 应用免疫荧光双标染色法检测。石蜡切片脱蜡，2%正常羊血清工作液封闭非特异性结合位点，37℃湿盒内孵育60 min;离心去血清，予CD4多克隆抗体(1∶1 000)、Foxp3单克隆抗体/RORγt单克隆抗体(1∶500)依序孵育。磷酸缓冲液(PBS)冲洗后，切片予1∶50稀释的FITC标记的抗兔IgG和1∶50稀释的rhodamine标记的抗鼠IgG孵育。对照切片予正常兔血清和PBS来代替Ⅰ抗孵育。PBS冲洗后，AEC水性封片剂封片，在共聚焦显微镜(Leica SP2)下观察，激发波长分别为488 nm和543 nm。细胞计数采用在400×镜下计数形态完整的阳性细胞，6张切片/每只动物，每张切片镜下统计200个细胞中的阳性细胞数量。

3 统计学处理

用SPSS 15.0统计软件进行统计分析，数据用均数±标准差(±s)表示，计量资料组间比较根据数据分布类型分别采用单因素方差分析和秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 模型的鉴定及评价

1.1 大鼠关节炎足爪评分 造模后CIA组大鼠平均第18 d出现明显关节炎症状，后足首先出现红肿，然后前足红肿，随时间延长，于21 d左右达到高峰，严重者不能负重，关节活动障碍，提示大鼠CIA模型建立成功。TNFR-Fc治疗组大鼠出现关节炎时间与模型组大致相似，高峰时间延迟至第28 d，且关节炎程度较CIA组显著减轻(P＜0.01)，见图1。对照组关节无异常改变。

Figure 1.The arthritis index of CIA rats.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs CIA.图1 CIA组大鼠和TNFR－Fc治疗组大鼠的关节炎指数

1.2 关节组织病理学检查 病理学观察结果显示，正常大鼠滑膜组织细胞排列规则，未见淋巴细胞及浆细胞的浸润及软骨染色缺失;CIA组大鼠关节滑膜组织呈重度增生，滑膜层变厚，排列紊乱，大量淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞浸润，软骨重度缺失;TNFR-Fc治疗组HE染色滑膜增生及炎症细胞浸润较CIA组轻，见图2。

1.3 血浆TNF-α浓度 ELISA结果显示CIA组TNF-α较正常对照组及TNFR-Fc治疗组显著升高［CIA 组(713.33 ±145.83)ng/L vs TNFR-Fc治疗组(67.62 ± 20.05)ng/L，正常对照组(24.86 ±3.12)ng/L］(P ＜0.01)，TNFR-Fc 治疗组与正常对照组间差异无统计学意义(P＞0.05)，见图3。

Figure 2.The synovial pathological characteristic from various groups(HE staining，×400).图2 各组大鼠关节滑膜病理学HE染色

Figure 3.Plasma TNF-α level in rats from various groups.±s.n=6.＊＊P ＜ 0.01 vs control and TNFR-Fc treatment.图3 三组大鼠血浆TNF－α水平

2 滑膜Foxp3和ROR－γt表达的比较

CD4被FITC标记为绿色荧光，Foxp3/RORγt被rhodamine标记为红色荧光，共表达的部分呈黄色荧光。结果显示Treg和Th17细胞主要分布在滑膜衬里细胞层及血管周围;CIA组的CD4+Foxp3+Treg/CD4+细胞比例与正常对照组无明显差异(23.12%±4.93%vs 24.66% ± 5.82%，n=6，P ＞ 0.05)，而TNFR-Fc治疗组则升高明显(33.07% ±5.14%);CIA组CD4+RORγt+Th17/CD4+细胞比例显著增高(9.74% ± 2.23%vs 正常对照组 1.00% ± 0.59%，TNFR-Fc 治疗组 5.63% ± 1.76%，n=6，P ＜0.01)，见图 4、5。

讨 论

RA是一种以慢性侵蚀性周围关节炎为主要表现的自身免疫性疾病。CIA由Trentham等［5］于1977年创立，用Ⅱ型胶原免疫大鼠诱导多关节炎症，由于其引起关节的症状和病理与 RA相似(滑膜增生、细胞浸润、软骨侵蚀、骨吸收和重塑)，被认为是人类RA的经典动物模型，较广泛地用于RA机制的研究以及RA药物干预治疗研究［6］。Lewis大鼠是制造CIA模型鼠的高度敏感鼠。本研究采用牛源性Ⅱ型胶原配合不完全弗氏佐剂成功诱导了CIA模型的发生。

既往认为 RA是Th1占优势的自身免疫病，但越来越多的研究结果提示Th1细胞可能在RA发病中并非占有主导地位［7-8］。Treg和Th17细胞的发现，弥补了Th1/Th2介导效应机制的不足。Treg和Th17细胞虽同属于CD4+T细胞，但生物学作用完全相反。IL-6和TGF-β等细胞因子作为关键因素决定着免疫应答是Treg占主导地位，还是Th17占主导地位:在稳定状态或无炎症损伤情况下，机体免疫系统产生的TGF-β抑制着效应T细胞的增殖，诱导初始T细胞向Treg分化;当存在炎症时，急性期蛋白IL-6大量产生，抑制了Treg的增殖，诱导初始T细胞向Th17分化［9］。对RA患者和动物模型的研究均表明Treg细胞在RA发病中有重要作用。在一些研究中已经证实，早期RA患者的外周血中的CD4+CD25+Treg的数量比健康对照低［10-11］，可能正是因为这种细胞数量上的缺失，导致了免疫抑制功能的低下，给疾病的发生发展创造了条件。Lawson等［11］发现治疗后病情控制良好的RA患者Treg水平与正常人则无明显差别，说明RA病程及治疗情况对Treg水平确实存在影响。Th17细胞主要分泌IL-17，还能分泌TNF-α、IL-21、IL-22和 IL-6;此外 IL-17可以和其它细胞因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ等相互作用产生协同效应。研究发现RA患者关节滑液中 IL-17 的含量明显升高［7］;动物实验［12］初步结果显示，在关节炎早期阶段应用中和性抗 IL-17抗体可以显著减轻关节炎的严重程度，即使在关节炎的晚期阶段抗 IL-17抗体仍然可以显著减缓病程的发展。最近有研究报道［13］，随着疾病活动性的增加，RA患者外周血CD4+T细胞中Th17细胞的比率增加而Foxp3+CD4+CD25+Treg细胞比率降低，导致Th17/Treg细胞比例失衡，并且平衡向Th17细胞一方偏移，提示RA患者体内的免疫抑制效应减弱而免疫炎性效应增强，二者的共同作用可诱导外周血T细胞亚群的紊乱以及外周免疫耐受的破坏，进而促进疾病的发生发展。

Figure 4.CD4-Foxp3 lymphocytes in synovium stained by double immunofluorescent labeling and observed by confocal microscopy(×400).Arrows pointed out CD4+Foxp3+Treg cells.图4 激光共聚焦显微镜下观察免疫荧光双染的滑膜中CD4－Foxp3淋巴细胞

Figure 5.CD4-RORγt lymphocytes in synovium stained by double immunofluorescent labeling and observed by confocal microscopy(×400).Arrows pointed out CD4+RORγt+Th17 cells.图5 激光共聚焦显微镜下观察免疫荧光双染的滑膜中CD4－RORγt淋巴细胞

本研究采用激光共聚焦显微镜观察CIA大鼠发病高峰期关节滑膜的Treg和Th17细胞，发现 CIA大鼠滑膜增生明显，Treg和Th17细胞主要分布在滑膜衬里细胞层及血管周围;Th17细胞表达水平比正常大鼠明显增多，而Treg细胞则与正常组相比无明显差异，提示CIA大鼠病变关节滑膜存在Treg/Th17分化失衡，可能是由于Treg的功能受抑，Th17细胞诱导分化，而使得Th17细胞占主导地位。因此抑制Th17细胞分化，促进Treg细胞生成，诱导免疫耐受，重新建立体内免疫稳态，可能是治疗RA等自身免疫性疾病的新思路。

近年来将TNF-α拮抗剂用于治疗活动性RA获得成功，临床试验表明抗TNF-α治疗不但能够改善RA患者的症状和提高功能，而且可以有效控制病情的进展，这是RA临床治疗的一个飞跃［14］。但是TNF-α拮抗剂治疗的作用机制还不完全清楚。我们之前的研究发现，抗TNF-α治疗的机制不仅仅是阻断TNF-α的促炎作用，还可减少关节滑膜及软骨骨桥蛋白的表达［4］。而 TNF-α拮抗剂对CIA关节滑膜Treg/Th17分化的影响，未见系统报道。目前批准上市的TNF-α拮抗剂主要有3种，分别为TNFR-Fc(肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白)、Infliximab(TNF-α的人鼠嵌合、含25%鼠蛋白和75%人蛋白的IgG1单克隆抗体)和Adalimumab(重组全人源TNF-α IgG1单克隆抗体)。本研究使用TNFR-Fc治疗CIA模型鼠后，TNFR-Fc治疗组血浆TNF-α值较CIA组明显降低，病理组织学评分亦显示TNFR-Fc治疗组关节及软骨的病变较CIA组明显轻。故TNFR-Fc对RA有较好的治疗作用，可显著减轻滑膜炎症和抑制滑膜增生，与文献报道结果一致。我们进一步观察TNFR-Fc治疗对关节滑膜Treg/Th17的影响，结果显示TNFR-Fc治疗组的Treg细胞显著高于CIA组和正常对照组;而Th17细胞则比CIA组明显减少，但高于正常对照组。有体外研究［15］结果认为TNFR-Fc并不能阻抑Th17细胞的诱导或恢复Treg细胞的生成，同时进行的CIA动物实验结果显示TNFR-Fc对外周Th17和Treg细胞没有影响，认为TNFR-Fc对关节炎的治疗作用与诱导Treg细胞无关。但与此相矛盾的研究报道比比皆是，如Ehrenstein等［16］报道的RA存在Treg细胞功能受损，抗TNF-α治疗不但使其免疫抑制功能恢复，还使其数量增加;Ricciardelli等［17］研究发现，接受TNF-α拮抗剂治疗的Crohn’s病患者与接受传统治疗方法的患者相比较，其肠道黏膜中的Foxp3+的细胞比例和Foxp3 mRNA的表达均显著升高，提示抗TNF-α治疗可能影响黏膜调节性T细胞的活化和扩增;Notley等［18］进行的CIA动物实验，采用流式细胞术检测Th17细胞，结果则显示TNFR-Fc导致外周血Th17细胞扩增，但关节滑液的Th17细胞却明显减少，推测可能是因为TNFR-Fc抑制Th17细胞聚集于关节。我们的研究结果与之相似，不同的是我们同时检测关节滑膜Treg/Th17细胞的变化，而且采用激光共聚焦显微镜更直观地观察病变关节滑膜Treg/Th17细胞的定位，排除自发荧光、成团细胞或细胞碎片的干扰;但缺点是观察细胞数目有限，存在主观因素影响。我们的研究结果提示CIA大鼠关节滑膜的Treg细胞数量没有明显减少，但可能存在功能受抑，Th17细胞增多，病变关节滑膜存在Treg/Th17分化失衡;TNFR-Fc可能通过抑制关节滑膜Th17细胞分化，诱导Treg细胞生成/聚集，使得病变关节的Treg/Th17平衡得以恢复，从而打破炎性瀑布的环路，恢复机体免疫耐受功能而缓解病情。

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