慢性神经痛大鼠鞘内联合应用吗啡和氯胺酮在脊髓上水平的抗伤害性作用及对吗啡耐受的影响

吕 金，陈 华，崔健君

疼痛产生的中枢机制涉及中枢神经系统内多个脑区对疼痛信号的整合。以往对其机制的研究大多集中于脊髓水平，而在脊髓以上水平的研究较少。一氧化氮(NO)是中枢神经系统内重要的生物活性物质，参与神经病理性疼痛脊髓水平的发病机制［1］，但在脑组织各区的变化尚不清楚。本文拟通过研究吗啡和氯胺酮对神经病理性痛大鼠脑组织各区(大脑皮质、海马、脑干)NO浓度和一氧化氮合酶(NOS)活性的影响，探讨其脊髓上水平抗伤害性作用的机制及对吗啡耐受的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 选健康雄性Wistar大鼠(由中国医科大学盛京医院动物实验中心提供)，体质量200～250 g。盐酸吗啡注射液(沈阳第一制药厂);盐酸氯胺酮注射液(江苏恒瑞药业股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 参照杨建平等［2］的方法进行大鼠鞘内置管:大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，俯卧位固定，在L3－4间隙处纵切口暴露并分离L3与L4棘突间隙，向头侧置入导管，插管深度2 cm，见清亮脑脊液从导管内缓慢流出，证实导管在蛛网膜下腔，导管开口头端引出于颈背部，外露1 cm固定。参照 Bennett等［3］的方法制备大鼠右侧坐骨神经结扎(CCI)模型:取右后肢外侧切口，在股骨后找到坐骨神经主干，用4条肠线(4－0号肠线)分别相距约1 mm的间距做松弛结扎，直到神经外膜稍稍受压为止，结扎标准为使坐骨神经支配区域的肌肉出现暂短的收缩为止［4］。

1.2.2 分组 大鼠随机分为5组(B、C、K、M、KM组)，每组8只，其中C、K、M、KM组制备CCI模型并进行鞘内置管。B组为空白对照组，不实施任何手术，不用药;C组鞘内注射0.9%盐水10 μL;K组鞘内注射氯胺酮50 μg;M组鞘内注射吗啡20 μg;KM组鞘内注射吗啡10 μg和氯胺酮25 μg。CCI术后第4天开始鞘内给药，1次/d，连续7 d。所有药品均用生理盐水溶解至10 μL，注药后用生理盐水10 μL冲管。各组动物鞘内给药7 d后断头处死，冰上迅速取出大脑，分离大脑皮质、海马、脑干组织，采用硝酸还原酶法测定NO浓度和NOS活性，NO和NOS测试剂盒由南京建成生物和工程研究所提供。

1.3 统计学处理 采用SPSS 10.5统计软件进行处理，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠用药7 d后脑组织各区NO浓度的比较 与B组比较，C和K组脑干NO浓度升高，M组皮质、海马、脑干中均升高;与C组比较，M组皮质、海马NO浓度升高，KM组海马、脑干中降低;与M组比较，KM组皮质、海马、脑干NO浓度均升高(P＜0.05或0.01)。见表1。

表1 各组大鼠用药7 d后脑组织各区NO浓度的比较(μmol/g prot，n=8，±s)

表1 各组大鼠用药7 d后脑组织各区NO浓度的比较(μmol/g prot，n=8，±s)

注:与B组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与C组比较，$P＜0.05，$$P＜0.01;与M组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

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2.2 各组大鼠用药7 d后脑组织各区NOS活性的比较 与B组比较，C、K和M组皮质、海马、脑干中NOS活性均升高;与C和M组比较，KM组皮质、海马、脑干中NOS活性均降低(P＜0.05或0.01)。见表2。

3 讨论

研究发现，内源性NO是中枢神经系统内重要的神经递质，在脑内主要来源于血管内皮细胞，其次为含NOS的神经纤维、神经元和胶质细胞。NO产生后直接向四周扩散，透过细胞膜进入组织内发挥作用［4］。

表2 各组大鼠用药7 d后脑组织各区NOS活性的比较(U/mg prot，n=8，±s)

表2 各组大鼠用药7 d后脑组织各区NOS活性的比较(U/mg prot，n=8，±s)

注:与B组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与C组比较，$P＜0.05，$$P＜0.01，与M组比较，#P＜0.01

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本研究结果显示，慢性坐骨神经结扎产生痛觉过敏后，大鼠皮质、海马、脑干组织中NOS活性均增加，脑干NO浓度也高于B组，Onal等［5］的研究结果与本研究相似，他们认为慢性疼痛刺激使脑干NO浓度明显增加，但并没有对其他脑区进行观察。解剖学研究证实，NOS阳性神经元在中枢神经系统内多个脑区都有定位，而且存在脑干及下丘脑NOS阳性神经元向海马的投射［6］。脑干中线结构是机体内源性痛觉调制系统的中心结构，海马长时程增强是中枢可塑性变化的机制之一［7］，且由于大脑皮质是中枢神经系统的最高级中枢，慢性疼痛使这三个脑区NOS活性均明显增加，由此可见，NO与NOS参与了脊髓上水平的痛觉调制，NO在脊髓上水平主要是疼痛的易化递质。这其中的具体机制尚不清楚，推测可能与NMDA受体的激活有关。

本研究证实，吗啡单独鞘内用于CCI大鼠在早期可产生较好的镇痛作用，但长时间应用镇痛效果下降，可产生耐受;鞘内联合应用吗啡和氯胺酮既可减少吗啡的用量，又具有良好的抗伤害性作用，且随时间延长镇痛效果优于吗啡组［8］。本研究发现，鞘内单独应用吗啡使大鼠皮质、海马、脑干NO浓度和NOS活性升高，这可能是吗啡耐受产生的机制之一。有研究认为，NOS抑制剂能有效阻止吗啡镇痛耐受，而NO供体可加速吗啡耐受的进程，认为NO是导致吗啡耐受的关键因素［9］。吗啡和氯胺酮联合应用可使各脑区NO浓度和NOS活性低于吗啡组，这可能与两者合用能够抑制吗啡耐受的形成有关。有学者认为，小剂量氯胺酮对NMDA受体的作用不应该认为是传统意义上的“镇痛”，而应该考虑为“抗疼痛过敏”、“抗异常痛”和“对耐受的防护作用”［10］。

综上所述，神经病理性痛大鼠鞘内联合应用吗啡和氯胺酮可在脊髓上水平产生抗伤害性作用，并可抑制吗啡耐受的形成，这可能与大脑皮质、海马、脑干的NO水平和NOS活性有关。

［1］ 陈华，张锦，崔健君.鞘内联合应用吗啡和氯胺酮对神经痛大鼠脊髓NOS活性和NO产量的影响［J］.中华麻醉学杂志，2004，24(3):203－205.

［2］ 扬建平，蒋豪，吴珏.大鼠蛛网膜下腔埋管并长期留置操作的改进［J］.中华麻醉学杂志，1993，13(2):110－112.

［3］ Bennett GJ，Xie YK.A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man［J］.Pain，1988，33(1):87－107.

［4］ Okuducu H，Onal SA.Is nitric oxide involved in the antinociceptive activity of tramadol Findings in a rat model of neuropathic pain［J］.Agri，2005，17(4):31－40.

［5］ Onal A，Delen Y，Ulker S，et al.Agmatine attenuates neuropathic pain in rats:Possible mediation of nitric oxide and noradernergic activity in the brainstem and cerebellum［J］.Life Sci，2003，73(4):413－428.

［6］ 熊克仁，马同军，郭平石，等.脑干及下丘脑内一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元向海马的投射［J］.四川解剖学杂志，1998，6(2):69－71.

［7］ Wakasugi M，Hirota K，Roth H，et al.The effect of general anesthetics on excitatory and inhibitory synaptic transmission in area CA1 of the rat hippocampus in vitro［J］.Anesth Analg，1999，88(3):676－680.

［8］ 陈华，张锦，孟凌新，等.鞘内联合应用吗啡和氯胺酮对神经痛大鼠痛行为的影响［J］.中国医科大学学报，2005，34(4): 304－305.

［9］ Kielstein A，Tsikas D，Galloway GP，et al.Asymmetric dimethylarginine(ADMA)－A modulator of nociception in opiate tolerance and addiction［J］.Nitric Oxide，2007，17(2):55－59.

［10］ 刘国凯，黄宇光，罗爱伦.小剂量氯胺酮用于术后镇痛的研究及其临床价值［J］.中华麻醉学杂志，2003，23(3):238－240.