甘草甜素对接触性皮炎小鼠表皮内结合珠蛋白的影响

郭 哲，高兴华，夏立新，王雅坤，马丽娟，何春涤，陈洪铎

肝脏在体内平衡被破坏时，会合成一组急性期蛋白，其作用是参与宿主对感染及损伤组织修复中的防御，进而保持体内平衡［1］。结合珠蛋白(Hp)是急性期蛋白之一，在肺、肝、肾上腺、脂肪组织、输尿管、附睾、卵巢、颌下腺、皮肤中均有表达［2-3］。正常小鼠的Hp mRNA表达于表皮角质形成细胞和毛囊上皮细胞中［4］。Hp有抗氧化、抗炎作用［5-7］，对淋巴细胞功能有很强的免疫抑制作用。Xie等［8］发现，Hp通过阻止朗格汉斯细胞功能转换和激活T细胞来干预朗格汉斯细胞，起到抑制朗格汉斯细胞功能的作用。Arredouani等［9］发现，接触性皮炎血中Hp浓度升高。本文观察甘草甜素处理后的接触性皮炎小鼠皮肤中的Hp表达改变，现报道如下。

1 材料

1.1 实验动物 BALB/c小鼠126只，由中国医学科学院实验动物研究所提供。均为SPF级雌性，6～8周，体质量(20±2)g。

1.2 实验仪器 pH计(美国 Queue SystemsTM2711型);解剖显微镜(南汇光学仪器厂);电热恒温水箱(河北黄骅航天仪器厂，TDW-2002型);电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器公司，DH3600A型);光学显微镜(日本Olympus);深低温冰箱(日本SANYO，Altra Low);紫外分光光度计(美国Spectronic GeneSys TM 2711型);电泳仪(北京六一仪器厂，DYY-Ⅲ2型);电泳槽(北京六一仪器厂，DYY-Ⅲ2型);全能型高性能台式冷冻离心机(德国Heaeus，Biofuge Stratos);组织匀浆机(德国Heidohp，Diax 900型);PCR扩增仪(德国Biometra，T-Gradient);紫外凝胶成像系统(英国 Gel workers eD，UVP GDS8000)。

1.3 主要试剂 甘草甜素(GL，商品名:美能，日本美能发源制药公司。2 mL/支，含GL 40 mg)。地塞米松磷酸钠注射液(郑州红惠制药有限公司，1 mL/支，2 mg/mL)。RT-PCR试剂:Trizol RNA提取试剂(Invitrogen公司)和 RT-PCR试剂盒(Takara公司)。原位杂交试剂:Haptoglobin原位杂交检测试剂盒(MK1806)购自武汉博士德公司。引物合成:两对引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩增用引物见表1。

2 方法

2.1 小鼠接触性皮炎模型的建立［10］小鼠于实验前1 d用脱毛剂除去腹部毛，实验第1天和第2天于每只小鼠去毛部位涂1%二硝基氯苯(DNCB，溶于4∶1丙酮∶橄榄油)50 μL各一次致敏。实验第6天，病侧耳内外侧各涂0.5%DNCB 10 μL 1次激发;右耳内外侧各涂4∶1丙酮∶橄榄油10 μL 1次，作为对照。

表1 PCR扩增用引物

2.2 动物分组 将126只小鼠随机分成7组，每组18只，分别为生理盐水组，GL 5、10、20、40、80 mg/kg，地塞米松1 mg/kg组(Dexa组)。在激发后腹腔注射药物，每天1次，每次0.2 mL，连续3 d。在激发后24、48、72 h用环钻取下的左右耳皮损称重后分成2份，一份用于原位杂交，另一份于－70℃冻存，以备提取总RNA。

2.3 小鼠皮肤的真表皮分离［10］用刀片刮除小鼠耳朵表面的皮脂和皮屑，除去皮下脂肪。PBS冲洗后，用镊子分离小鼠耳的两层皮肤，刮除软骨，切成0.5 cm×0.5 cm小块，加入EDTA分离液中37℃水浴，1 h后取出皮片将真表皮分开，留做原位杂交。

2.4 RT-PCR操作步骤

2.4.1 组织总RNA的提取 按照每100 mg组织中加1 mL trizol试剂，将分离好的表皮放入适量trizol试剂中，在冰浴中用匀浆机进行匀浆。匀浆速度为4档。将匀浆后的样品，冰浴5 min。按照每1 mL trizol试剂中加入0.2 mL氯仿的标准，加入适量氯仿，用力摇晃15 s，冰浴3 min。4℃以10 000 r/min离心15 min。离心后将上层无色水相移入另一新管中，按照每1 mL trizol试剂中加入0.5 mL异丙醇的标准，加入适量异丙醇。冰浴20 min。4℃以10 000 r/min离心10 min。去除上清，按照每1 mL trizol试剂中加入1 mL 75%乙醇的标准，加入适量75%乙醇。涡旋标本。4℃下，以6 000 r/min离心5 min。去除上清，空气中干燥 10 min。用0.1%DEPC水10 μL溶解RNA。

2.4.2 RNA浓度和纯度测定 取1 μL RNA溶液，用0.1%DEPC水稀释至80 μL，在紫外分光光度仪上测定RNA溶液在260 nm和280 nm处的光密度(OD)值。RNA浓度(μg/mL)=OD260×稀释倍数×40/1 000(μg/mL)。RNA纯度=OD260/ OD280，当OD260/OD280≥1.6时，认为所提取的RNA质量较好，能够进行后续操作。

2.4.3 RT-PCR反应 ①RT反应体系:10×RT缓冲液1 μL，25 mM MgCl22 μL，dNTP混合物(各10 mM)1 μL，逆转录酶0.5 μL，RNA酶抑制剂0.25 μL，Random 9 mers 0.5 μL，总RNA(≤500 ng)2 μL，加0.1%DEPC水至总容积10 μL。②RT反应条件为:30℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃5 min，5℃5 min，1循环。③PCR反应体系:cDNA 10 μL，5×PCR缓冲液10 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，20 pmol的上游或下游引物各0.5 μL，加0.1%DEPC水至总容积50 μL。④PCR反应条件为:94℃2 min，1循环;94℃40 s，60℃40 s，72℃1 min，32循环;72℃8 min，1循环;4℃5 min，1循环。

2.4.4 Hp引物 上 游:5'-ACCTTAAACG ACGAGAAGCAATGG-3';下游:5'-AGCCAGACACGTAGCCCaCACG-3'，片段大小为475 bp。内对照βactin:上游:5'-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3';下游:5'-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3'，片段大小为540 bp。

2.4.5 PCR产物检测 将1.5%琼脂糖凝胶置于含0.5×TBE的电泳槽中，取10 μL扩增引物与2 μL 6×上样混合液混合后上样。溴化乙啶染色。电泳结束后，在紫外凝胶成像系统上照相。

2.4.6 质量控制 设立内对照、空白和阳性对照。内对照:用β-actin引物扩增。空白对照:用0.1%DEPC水代替RNA作为模板，进行RT-PCR反应。阳性对照:从小鼠肝脏组织提取RNA作为模板，进行RT-PCR反应。

2.4.7 结果判定 染色后的产物用 FlourChen Gel Imaging System(Alpha America)进行图像分析。结果用Hp扩增产物与内对照β-actin扩增产物密度之比来表示，称为Hp相对转录产物或Hp mRNA水平。每一密度值为4次独立实验所得平均值。每一实验在相同条件下进行。结果以±s表示。

2.5 原位杂交检测

2.5.1 操作步骤 ①表皮用4%多聚甲醛固定液室温固定30 min，蒸馏水充分洗涤。②将表皮放入新鲜配制的0.5%H2O2的甲醇溶液中，室温处理30 min;蒸馏水洗涤3次。③用3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37℃消化1 min，蒸馏水洗涤1次。④每张片子加预杂交液20 μL后于37℃恒温箱孵育4 h。⑤每张片子加含Hp寡核苷酸探针的杂交液20 μL，盖上原位杂交专用的盖玻片，42℃恒温箱内过夜。⑥37℃ 2×SSC冲洗5 min×2，0.5×SSC冲洗15 min×1，0.2×SSC冲洗15 min ×1;加封闭液，37℃湿盒内孵育30 min。⑦加生物素化鼠抗地高辛抗体，37℃湿盒内孵育60 min，PBS冲洗5 min×4。⑧加SABC(链霉亲合素生物素复合体)，37℃湿盒内孵育20 min，PBS冲洗5 min×4。⑨加生物素化过氧化物酶，37℃湿盒内孵育20 min，PBS冲洗5 min×4。⑩加底物AEC (3-氨基-9-乙基卡巴唑)后室温显色30 min，蒸馏水终止。在解剖显微镜下铺片，自然风干后，甘油明胶封片。

2.5.2 质量控制 设立阳性对照和阴性对照。阳性对照为小鼠肝脏组织，阴性对照为不含Hp mRNA的小鼠心脏组织。

2.5.3 结果判定 对每个标本进行观察，胞浆着色呈橘红色为Haptoglobin mRNA阳性。染色结果分5级:无染色，为阴性(-);轻微染色，为弱阳性(±);染色较浅，为阳性(+);染色较深，为较强阳性(++);染色深，为强阳性(+++)。

3 结果

3.1 RT-PCR结果 见表2。激发后24 h，与生理盐水组相比，GL 5 mg/kg和10 mg/kg组小鼠表皮475 bp处扩增带表达明显增强，GL 80 mg/kg和Dexa组扩增带明显减弱。激发后48 h，与生理盐水组相比，GL 5 mg/kg和10 mg/kg组小鼠表皮475 bp处扩增带仍表达增强，GL 80 mg/kg和Dexa未见扩增带。激发后72 h，与生理盐水组相比，各组表皮均未见扩增带。总体上看，48 h扩增带明显弱于24 h。真皮中各时间点均未见Haptoglobin mRNA表达。内对照:所有标本均可用β-actin扩增出540 bp片段。空白对照:未扩增出475 bp片段或540 bp片段。阳性对照:小鼠肝脏组织用Hp引物扩增出475 bp片段，用β-actin扩增出540 bp片段。

3.2 原位杂交结果 见表3。激发后24 h，GL 5 mg/kg和10 mg/kg组染色强于生理盐水组;GL 20 mg/kg和40 mg/kg组染色强度与生理盐水组相似;GL 80 mg/kg和Dexa组染色弱于生理盐水组。激发后48 h，染色强度普遍弱于24 h，GL 5 mg/kg、10 mg/kg组染色强度强于生理盐水组; GL 20 mg/kg和40 mg/kg组染色强度与生理盐水组相似;GL 80 mg/kg和Dexa组未见阳性染色。激发后72 h各组均未见阳性染色。各组真皮内未见Hp mRNA表达。阳性对照:小鼠肝细胞胞浆明显红染。阴性对照:无胞浆特异性染色出现。

表2 GL对接触性皮炎小鼠表皮Hp mRNA表达的相对值(RT-PCR结果)

表3 GL对接触性皮炎小鼠表皮Hp mRNA表达强度的影响(原位杂交结果)

4 讨论

无论是用RT-PCR还是原位杂交方法，笔者发现，激发后 24、48 h，与生理盐水组相比，GL 5 mg/kg、10 mg/kg组 Hp mRNA表达增强，GL 80 mg/kg和地塞米松组表达减弱。说明甘草甜素双相调节接触性皮炎小鼠表皮内结合珠蛋白的表达。低剂量GL能增强小鼠表皮内Hp mRNA的表达，高剂量GL和地塞米松能减弱小鼠表皮内Hp mRNA的表达。

LC本身不能合成Hp，通过胞吞及胞吐方式摄取和排出Hp，而角质形成细胞能合成Hp［11］。Kim等［12］认为，Hp抑制表皮内不成熟的LC向成熟的抗原递呈细胞转变，具有免疫调节和抗炎作用，可能是抑制炎症部位过度的炎症反应的反馈因子之一。笔者以前的实验发现，GL5 mg/kg、10 mg/kg组可以使LC密度降低，同时减轻炎症反应，而本次实验又显示，两组表皮内Hp mRNA表达增强，因此，推测Hp可能与LC的密度降低有关。Hp mRNA表达增强，意味着更多的Hp发挥抗炎作用，使不成熟的LC向成熟的抗原递呈细胞转变受到抑制，从而使接触性皮炎小鼠的炎症反应减轻。GL 80 mg/kg和Dexa组Hp mRNA表达减弱，发挥抗炎作用的Hp减少，这也与临床实际情况相一致。笔者认为，GL增加Hp mRNA表达，可能是GL素治疗接触性皮炎的机制之一。Dexa组Hp mRNA表达减弱，说明甘草甜素和地塞米松对Hp的影响是通过不同的机制实现的，两者治疗接触性皮炎的机制也是不同的。

因为皮肤中Hp含量少，RT-PCR方法所用标本不是新鲜标本，原位杂交方法用的是新鲜标本，此外，应用的是铺片而不是切片，所以本文用原位杂交的方法检测Hp mRNA的表达，两种方法各有不足，但结果一致，说明从mRNA水平对Hp进行的检测是真实的。

总之，GL能增强小鼠接触性皮炎表皮内Hp mRNA的表达，说明GL能对急性期蛋白发挥药理作用，这可能是其治疗接触性皮炎的机制之一。

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