抑制活化素受体样激酶5对增生性瘢痕成纤维细胞中胶原蛋白沉积的影响

孟祥慧，张建波，初金玉

病理性瘢痕(包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩)是人体皮肤组织损伤后的一种纤维过度增生性疾病。在增生性瘢痕形成中，胶原代谢的失调起着重要的作用。胶原蛋白主要产自成纤维细胞和内皮细胞，而增生性瘢痕成纤维细胞有更强的产生胶原能力［1］。转化生长因子(Transforming growth factor，TGF)β是一种重要的致纤维化因子，动物实验研究表明，给予外源性TGF-β可促进纤维化和瘢痕反应，抑制TGF-β信号通路则可有效地抑制瘢痕化［2-3］。活化素受体样激酶5(Activin receptor-like kinase 5，ALK5)是TGF-β的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体，对TGF-β的信号转导起着关键作用。研究表明，抑制ALK5可降低肺脏的纤维化基因表达和胶原沉积［4］。本研究以增生性瘢痕原代培养的成纤维细胞为研究对象，观察ALK5抑制剂CP-639180对瘢痕成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白(Collagen type I，COL1A2)和α-平滑肌肌动蛋白(Smooth muscle actin，SMA)表达的影响，探讨ALK5抑制剂在增生性瘢痕治疗中的可能应用和作用机制。

1 材料

1.1 试剂及药品 CP-639180(Sigma);达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM，Gibco);胎牛血清(Hyclone); TRIzol(Invitrogen);PrimeScriptRT-PCR Kit (DRR037S，TaKaRa);α-SMA、COL1A2及内参GAPDH定量PCR引物由TaKaRa公司合成(序列见表1);胞浆蛋白提取试剂盒(凯基生物);辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG(sc2030，Santa Cruz);兔抗人α-SMA多克隆抗体(ab5694，Abcam);兔抗人 COL1A2及 β-actin多克隆抗体(sc28655和sc130656，Santa Cruz)。

1.2 组织标本 6例增生性瘢痕组织标本来源于哈尔滨医科大学附属第二医院整形外科，术前均取得患者同意。患者年龄19～28岁，平均23岁，其中男4例，女2例，病程5个月～2年，均无系统性疾病和激素、其他药物注射史。

表1 荧光定量PCR引物

1.3 仪器 CO2培养箱(HERUS);超声波匀浆机(BioSpec);低温高速离心机(Eppendorf);PCR仪(Bio-Rad);荧光定量PCR仪LightCycler(Roche);酶标测定仪(Bio-Rad);垂直平板蛋白电泳及转膜装置(Bio-Rad);G∶BOX系列全自动凝胶成像系统(Gene)。

2 方法

2.1 原代细胞培养 采用组织贴块法进行成纤维细胞原代细胞培养［5］，无菌条件下将手术切下的瘢痕剪成小于0.5 mm3碎块，平铺于培养皿中，用DMEM(含胎牛血清)培养基进行贴壁培养，3～4周后细胞长至融合状态，用0.25%胰蛋白酶消化，进行传代培养，实验用第6～10代细胞。用0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种于12孔培养板，分别加入不同终浓度(1、5、10 μM)的CP-639180(DMSO溶解)以及同浓度的DMSO(对照)，孵育3 h后收集细胞冻存，每种浓度设3个复孔。

2.2 荧光定量PCR 采用Trizol试剂提取成纤维细胞总RNA，分光光度法测定RNA浓度。取1 μg总RNA逆转录生成cDNA，实时荧光定量PCR反应在LightCycler上进行，反应条件:94℃ 10 s，60℃20 s，40个循环后溶解曲线分析证实扩增的特异性，每个样本重复实验3次，取平均值。采用2-△△CT法计算靶基因mRNA经内参GAPDH标化后的相对含量［6］。

2.3 Western blot 按照试剂盒说明提取成纤维细胞胞浆蛋白，BCA法测定蛋白浓度，按每孔20 μg总蛋白的浓度上样，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，成层胶浓度5%，分离胶浓度10%)分离蛋白，电转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(4℃，200 mA，1.5 h)。转印膜封闭后，分别与抗COL1A2抗体(1∶800)、α-SMA抗体(1∶400)和β-actin的抗体(1∶1 000)4℃杂交过夜，然后与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶2 000)室温孵育2 h，ECL化学发光系统检测反应产物信号。每个标本重复3次，取平均值，以β-actin为内参进行相对定量分析。

2.4 数据处理 采用SPSS 11.0软件进行统计分析，数据用±s表示，均数比较采用one-way ANOVA方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 ALK5抑制剂对瘢痕成纤维细胞中COL1A2表达的影响 定量PCR检测结果表明，不同剂量的ALK5抑制剂处理3 h后，瘢痕成纤维细胞中COL1A2的mRNA相对表达量明显低于对照组，分别是对照组的63.31%、32.39%和14.75%(P＜0.05，P＜0.01)，见图1。与对照组比较，抑制剂处理组成纤维细胞中COL1A2蛋白含量明显降低，且随着抑制剂浓度的增加，COL1A2的蛋白水平逐渐降低(P均＜0.05)，见图2、图3。

图1 ALK5抑制剂处理后瘢痕成纤维细胞中COL1A2和α-SMA的mRNA相对水平(n=6)注:与对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

图2 ALK5抑制剂处理后瘢痕成纤维细胞中COL1A2和α-SMA蛋白的相对表达量(n=6)注:与对照组比较，*P＜0.05

图3 Western blot检测ALK5抑制剂对瘢痕成纤维细胞中COL1A2和α-SMA蛋白表达的影响

3.2 ALK5抑制剂对瘢痕成纤维细胞中α-SMA表达的影响 采用同样实验方法研究ALK5抑制剂对瘢痕成纤维细胞中α-SMA表达的影响，随着CP-639180浓度的增加，瘢痕成纤维细胞中α-SMA的mRNA表达水平逐渐降低(P均＜0.05)，见图1。Western blot检测结果与定量PCR结果相似，成纤维细胞中α-SMA蛋白相对含量明显降低，分别是对照的60.82%、46.37%和29.67%(P均＜0.05)，见图2、图3。

4 讨论

增生性瘢痕是临床常见的病理性瘢痕，可导致相关组织或器官功能障碍，运动受限以及严重的心理创伤［7］。其病理基础是以成纤维细胞为主的细胞成分的过度增殖和以胶原为主的细胞外基质的过度沉积。成纤维细胞是创面愈合的主要修复细胞，它在创面修复过程中活化、增殖、合成胶原，在正常的伤口愈合过程中，胶原蛋白的合成代谢与降解代谢之间维持平衡状态。但在增生性瘢痕中，成纤维细胞胶原合成增加、降解减少，打破了这种平衡状态，最终导致胶原蛋白的大量沉积，而又以Ⅰ型胶原蛋白的含量最多。

目前研究认为，增生性瘢痕的发生发展与生长因子(TGF-β、血小板源生长因子)活性的增强以及细胞外基质的改变有关。在增生性瘢痕中，I型胶原蛋白和TGF-β表达都异常增多［8］。TGF-β是与瘢痕形成最密切的信号分子，在伤口愈合过程的功能包括刺激成纤维细胞的增殖，诱导胶原蛋白合成;抑制肌成纤维细胞的凋亡，从而增加细胞外基质沉积;诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，后者具有成纤维细胞和平滑肌细胞的特征和功能，表达高水平的α-SMA［9-10］。陈伟等［11］研究发现，胎儿伤口无瘢痕愈合的部分机制即在于皮肤中TGF-β1的低表达。TGF-β诱导细胞外基质的沉积及细胞表型转化主要是通过Smads信号通路介导的，ALK5是惟一介导经TGF-β膜受体正向调控Smads信号通路传递TGF-β生物信号的受体激酶。对动物脏器纤维化模型研究结果表明，采用小分子抑制剂抑制ALK5活性可降低脏器中纤维化基因表达和胶原沉积，减少纤维化程度［12］。为探讨抑制ALK5活性对增生性瘢痕成纤维细胞功能的影响，我们采用已知的高效ALK5特异性抑制剂CP-639180，观察其对增生性瘢痕成纤维细胞胶原蛋白表达的影响。结果显示，CP-639180在体外从转录水平上抑制I型胶原蛋白的表达。I型胶原蛋白表达的多少可以直接反应组织瘢痕化的程度。研究还发现，CP-639180以剂量依赖模式抑制成纤维细胞中α-SMA的表达，提示ALK5抑制剂可减少人瘢痕组织中成纤维细胞向表达α-SMA的肌成纤维细胞转化。α-SMA是肌成纤维细胞的典型标志，与创面收缩密切相关。它通过纤纵融合膜与成纤维细胞外纤维粘连蛋白相连，后者可与细胞外基质或其他成纤维细胞相连，从而把成纤维细胞的收缩传导至整块组织。

综上，本研究发现，应用小分子ALK5抑制剂CP-639180可以抑制增生性瘢痕成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白和α-SMA，进一步抑制胶原纤维的合成和肌成纤维细胞转化。但是，ALK5抑制剂在增生性瘢痕发生发展中还存在哪些作用，能否成为新的有效的增生性瘢痕治疗方法，仍有待于进一步的研究。

［1］ Eckes B，Zigrino P，Kessler D，et al.Fibroblast-matrix interactions in wound healing and fibrosis［J］.Matrix Biol，2000，19 (4):325-332.

［2］ Wynn TA.Common and unique mechanisms regulate fibrosis in various fibroproliferative diseases［J］.J Clin Invest，2007，117(3):524-529.

［3］ Daniels JT，Schultz GS，Blalock TD.Mediation of transforming growth factor-beta(1)-stimulated matrix contraction by fibroblasts:a role for connective tissue growth factor in contractile scarring［J］.Am J Pathol，2003，163(5):2043-2052.

［4］ Bonniaud P，Peter JM，Martin K，et al.Progressive transforming growth factor β1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor［J］.Am J Res Crit Care Med，2005，171(8):889-898.

［5］ 薛斌，王璞，董浦江.人瘢痕疙瘩成纤维细胞原代培养及生物学行为研究［J］.激光杂志，2007，28(2):95.

［6］ Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C (T))method［J］.Methods，2001，25(4):402-408.

［7］ Mustoe TA，Cooter RD，Gold MH，et al.International clinical recommendations on scar management［J］.Plast Reconstr Surg，2002，110(2):560-571.

［8］ Esson DW，Neelakantan A，Iyer SA，et al.Expression of connective tissue growth factor after glaucoma filtration surgery in a rabbit model［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2004，45(2): 485-491.

［9］ Denk P，Hoppe J，Hoppe V，et al.Effect of growth factors on the activation of human Tenon's capsule fibroblasts［J］.Curr Eye Res，2003，27(1):35-44.

［10］ Kottler UB，Junemann AG，Aigner T，et al.Comparative effects of TGF-beta1 and TGF-beta 2 on extracellular matrix production，proliferation，migration，and collagen contraction of human Tenon's capsule fibroblasts in pseudoexfoliation and primary open-angle glaucoma［J］.Exp Eye Res，2005，80(1): 121-134.

［11］ 陈伟，付小兵，葛世丽，等.胎儿和出生后机体皮肤内转化生长因子-β基因表达的变化［J］.中国危重病急救医学，2004，16(4):206-209.

［12］ De Gouville AC，Huet S.Inhibition of ALK5 as a new approach to treat liver fibrotic diseases［J］.Drug News Perspect，2006，19(2):85-90.