α－葡聚糖酶在毕赤酵母中的组成型表达*

梁达奉 黄曾慰 曾练强 蚁细苗 李雨虹 余林

(1.广东工业大学轻工化工学院，广东广州510006;2.广州甘蔗糖业研究所广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州510316)

甘蔗如受到刀伤或压伤、病虫害、火烧、霜冻或在收割后放置长时间，就会受到肠膜明串珠菌等微生物的感染而形成α－葡聚糖.从蔗汁澄清到糖的精炼，α－葡聚糖的存在给制糖工艺过程带来不良影响，主要体现在糖分损失、虚假旋光度的出现、糖液黏度增加、过滤困难、结晶不正常以及糖产品适用性受限制等.利用α－葡聚糖酶(EC 3.2.1.11)在制糖工艺过程分解而直接去除α－葡聚糖是目前最佳的选择:一方面，加入α－葡聚糖酶后，可消除α－葡聚糖对制糖工艺的负面影响，糖分回收提高3% ～5%，糖产品质量明显提高，使用任何其它澄清剂和化学助剂都无法达到此效果;另一方面，由经过认定的微生物产生的 α－葡聚糖酶是安全、无毒害的环保产品［1－3］.

目前商品化的 α－葡聚糖酶主要是从青霉属(Penicillium)和毛壳属(Chaetomium)等微生物中得到.由于真菌产酶的同时还会产生抗生素和其它有害代谢物，成为α－葡聚糖酶通过美国食品和药物管理局(FDA)认证的一个障碍.国内外也有报道利用基因工程方法表达α－葡聚糖酶的研究，尤其是毕赤酵母表达系统，但报道的毕赤酵母工程菌均为甲醇诱导型.在甲醇诱导型毕赤酵母工程菌产外源α－葡聚糖酶的研究中，Roca等［4］通过5 L发酵罐培养获得了接近3000 U/mL的酶活.近年来，Chen等［5］用5L发酵罐培养获得了83.9 U/mL的酶活，Kang等［3］用10L发酵罐取得了134 U/mL的酶活.甲醇诱导型的醇氧化酶(AOX1)启动子作为一种在研究和生产中广泛应用的启动子［6－7］，虽然具有高表达的特性和较成熟的发酵工艺，但是仍存在以下两个不足之处:(1)甲醇为易燃易爆物，给安全生产带来隐患;(2)甲醇具有毒性，作为诱导物加入发酵液后可能在产物中残留，增加了产品在食品、医药、饲料等领域应用的处理和检测成本.而pGAPZα属于组成型酵母表达载体，以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子作为外源基因启动子，不存在诱导的问题，在以葡萄糖或甘油等为碳源的培养基上就可以表达.研究表明该启动子的表达水平与以甲醇为诱导物的AOX1启动子的表达水平相当，是一种有巨大应用潜力的表达质粒［8－10］.与 AOX1 启动子相比，GAP启动子在保持强启动子特性的同时避免了前述的两个缺陷，发酵过程无需加入诱导物即可稳定表达目标蛋白，简化了生产流程，节省人力物力.而关于组成型毕赤酵母工程菌产外源α－葡聚糖酶的研究鲜见报道.本研究采用组成型质粒pGAPZαA作为表达载体，构建了组成型表达α－葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌，其在发酵过程中无需诱导，避免了甲醇的使用，因此提高了生产和使用安全性，降低了成本.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

含目的基因的载体pUC57－dex由广州甘蔗糖业研究所保存.毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株KM71H、质粒pGAPZαA购自美国Invitrogen公司;限制性内切酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、E.coli JM109感受态细胞、质粒小提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均购自日本Takara公司;Dextran T2000购自美国Pharmacia公司.寡核苷酸引物委托美国Invitrogen公司合成.低盐LB培养基(LLB)、YPD、YPDS培养基以及YPDS Zeocin抗性平板均按照美国Invitrogen公司的毕赤酵母表达手册配制.YPG培养基含酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、甘油30g/L.

主要仪器如下:MJ Mini型 PCR 仪、Pro－teanⅡ型蛋白电泳仪，美国BIO－RAD公司生产;DY－6C型核酸电泳仪，北京六一仪器设备有限公司生产;SKY－200B型全温度培养振荡器，上海苏坤实业有限公司生产;GEL LOGIC 200型凝胶成像系统，美国Kodak公司生产;2510型电转仪，德国Eppendorf公司生产.

1.2 表达载体pGAPZαA－dex的构建

扩增朱黄青霉(Penicillium minioluteum HI－4)基因组中的α－葡聚糖酶基因，其后连接入pUC57中得到克隆载体pUC57－dex.根据目的基因和表达载体pGAPZαA的序列特点，设计一对基因扩增引物，在上下游引物中分别引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点，相应地得到CACTCTCC3')，其中下划线所示为酶切位点.以质粒pUC57－dex为模板，PCR扩增条件为:95℃ 5 min，94℃ 1min，50℃ 1 min，72℃ 2 min，共 32 个循环;72℃10 min.用胶回收试剂盒回收扩增片段.用EcoRI和NotI限制性内切酶分别对回收的基因扩增片段和质粒pGAPZαA进行双酶切，条件为37℃ 12h.酶切产物经纯化后连接过夜.连接产物转化感受态大肠杆菌，在含25μg/mL Zeocin的LLB平板上筛选阳性克隆.挑取阳性菌落扩大培养，提取质粒后分别进行聚合酶链式反应(PCR)与EcoRI、NotI双酶切鉴定.酶切与PCR鉴定正确的阳性质粒送交测序，确认序列和读码框，最后验证无误的重组质粒命名为 pGAPZαA－dex.

1.3 重组工程菌 KM71H/pGAPZαA－dex的构建

表达载体pGAPZαA－dex使用AvrⅡ于37℃进行8h酶切使之线性化.琼脂凝胶电泳检测重组质粒是否酶切完全，检测后切胶回收，纯化产物.感受态酵母细胞的制备参照文献［11］.线性化质粒(10 μg)与感受态毕赤酵母KM71H(80 μL)混合，电击转化条件为:1500V、25μF、200 Ω.酵母细胞转化之后涂布于 YPDS 抗性平板上(含 100 μg/mL Zeocin)，30℃培养3～4天后长出单菌落.采用1.2中所述的引物P1和P2，以煮－冻－煮法［12］制备的转化子基因组作为模板进行PCR，能够扩增得到1700 bp左右片段的转化子为阳性转化子.

1.4 产酶工程菌的摇瓶发酵

通过不同梯度浓度Zeocin的YPD平板从阳性转化子中挑选出数株高拷贝克隆.将平板上的单克隆接入50 mL YPG培养基中作为一级培养，30℃、250 r/min的条件下培养至 D(600)=5.0时，取40mL接入360mL YPG培养基中继续培养.第72小时补加甘油，甘油补加量为培养基总量的3%.每隔12h取样测定湿重、D(600)、酶活.每隔24 h收集发酵液，12000r/min离心5min，收集上清.100mg三氯乙酸(TCA)加入1mL上清液，冰浴1 h.12000 r/min离心20 min，收集沉淀，溶于 100 μL磷酸盐缓冲液(PBS)，之后用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)分析.

酶活测定方法:将重组毕赤酵母发酵液经12000r/min离心5min的上清液稀释适当倍数后即为本实验所用酶液.取900 μL 0.02 g/mL的葡聚糖(Dextran T2000)溶液，置于45℃恒温水浴中至少保温5min，然后加100μL酶液.精确反应10min，立即加入2mL二硝基水杨酸钠试剂(DNS)以终止反应，沸水浴5 min，然后迅速将其冷却，用蒸馏水定容至25mL，于540nm下测定吸光值.从标准曲线的回归方程求得相对应的葡萄糖的量，并计算出酶活.酶活定义:采用DNS法，在45℃、pH=5.5的条件下，每分钟催化底物(0.02 g/mL Dextran T2000)水解产生1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活单位，以U表示.

2 结果与分析

2.1 表达载体pGAPZαA－dex的鉴定

以P1和P2作为引物通过PCR方法扩增α－葡聚糖酶基因，10g/L琼脂凝胶电泳(见图1)显示，得到单一DNA条带，长度约为1700bp，与设计的目的片段长度相符.

图1 PCR扩增α－葡聚糖酶基因Fig.1 PCR amplification of dextranase gene

如图2所示，α－葡聚糖酶基因经过PCR扩增后，与组成型分泌表达载体pGAPZαA连接，构建成重组质粒pGAPZαA－dex，目标基因之后连接有6×His标签的基因序列.

将连接好的表达载体进行PCR扩增鉴定，继而进行EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，结果见图3.将该阳性质粒送交Invitrogen公司测序，结果显示基因序列完整，无碱基突变，且重组表达载体的读码框正确，表达载体pGAPZαA－dex构建成功.

图2 重组质粒pGAPZαA－dex的结构Fig.2 Structure of recombinant plasmid pGAPZαA－dex

图3 质粒pGAPZαA－dex的双酶切鉴定Fig.3Characterization of pGAPZαA－dex by EcoRⅠ/NotⅠdigestion

2.2 重组工程菌的PCR鉴定

挑选若干Zeocin抗性平板上的转化子，采用煮－冻－煮法制备各转化子的基因组作为PCR检测的模板，PCR结果如图4所示.选出鉴定为阳性的转化子进行摇瓶发酵实验.

图4 经pGAPZαA－dex转化后KM71H的PCR验证Fig.4 Confirmation of KM71H transformed with pGAPZαA－dex by PCR

2.3 摇瓶发酵结果

挑选2.2摇瓶发酵实验中较高产的菌株在YPG培养中基摇瓶发酵，培养120h酶活达到60.4U/mL，菌体D(600)为38.7.接种12h之后菌体生长迅速，进入对数期.产酶量也随之较快地积累.培养72 h之后，酵母生长减缓，酶活积累也随之放缓.从发酵数据可知，72h时酶活达到50.4 U/mL，96 h时酶活达到58.5 U/mL，直至120 h达到顶点(见图5).实际上72 h至96 h之间即可作为发酵的终点取得最佳的效益.笔者正在进行的5 L发酵罐实验也验证了这一点.从酶活曲线和菌体密度曲线来看，二者不仅有较强的趋势一致性，而且还具有正相关性，说明发酵液中菌体密度越高，目标产物的浓度越高;这是组成型表达的一个显著特点.

图5 摇瓶发酵酶活和D(600)变化曲线Fig.5 Dextranase activity and D(600)profiles in shake flask cultures

分析预测 α－葡聚糖酶的相对分子质量为65000，SDS－PAGE分析显示发酵液上清中含有相对分子质量接近66000的特异条带，这说明本研究成功表达了α－葡聚糖酶(见图6).

图6 摇瓶发酵液上清SDS－PAGE分析Fig.6 SDS－PAGE analysis of supernatants from shake flask cultures

3 结语

本研究构建了组成型表达载体pGAPZαA－dex，以毕赤酵母为平台成功表达了α－葡聚糖酶，该融合蛋白相对分子质量约为66000，摇瓶发酵120h酶活达60.4U/mL.组成型毕赤酵母工程菌的发酵避免了有毒易燃易爆品——甲醇的使用，既便于大规模生产，也有利于发酵产品通过食品药品安全认证，为探索适用于制糖工业的α－葡聚糖酶的开发打下了基础.下一步将进行发酵罐流加培养工程菌的试验，逐级放大培养规模，通过优化发酵工艺和分离纯化工艺，降低α－葡聚糖酶的生产成本.

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