核桃JrLFY基因表达载体的构建及工程菌的筛选

何富强++王红霞++张志华++崔彬彬

摘要：为了研究核桃JrLFY基因的功能，利用RT-PCR技术扩增JrLFY基因ORF，设计含NdeⅠ/KpnⅠ酶切位点的引物获得该基因CDS区片段，用限制性内切酶NdeⅠ/KpnⅠ双酶切pRI 101-AN表达载体，利用In-Fusion技术成功构建pRI 101-AN·JrLFY表达载体，并将该表达载体转化农杆菌GV3101感受态细胞，成功获得工程菌，为其基因缺失或过表达等试验提供技术支持。

关键词：核桃；JrLFY基因；表达载体；工程菌

中图分类号：S664.1；Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）08-1573-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.044

Construction of Expression Vector and Selection of Engineering Strains from JrLFY Gene of Juglans regia L.

HE Fu-qiang1，WANG Hong-xia2，ZHANG Zhi-hua2，CUI Bin-bin1

（1.Department of Biochemistry， Baoding University， Baoding 071000，Hebei，China；2.Mountainous Areas Research Institute， Agricultural University of Hebei， Baoding 071001，Hebei， China）

Abstract： To make clear the function of JrLFY gene， its open reading frame（ORF） was cloned by RT-PCR in this paper. Then the CDS fragment was amplified by primers containing specific enzyme sites. The purified PCR product and the plant expression vector pRI 101-AN was digested by the restricted enzyme NdeⅠ/KpnⅠ. The final expression vector pRI 101-AN·JrLFY was constructed successfully by In-Fusion technique and transferred into agrobacterium stain GV3101. The genetic engineering strains were selected successfully， which will provide the technical support for the experiment such as gene deletion and gene overexpression and so on.

Key words： Juglans regia； JrLFY gene； expression vector； engineering strains

LFY基因作为花分生组织决定中的关键基因[1]，不仅参与促进花分生组织的形成、维持花分生组织的正常功能、花启动和防止花分生组织的逆转，而且还参与花分生组织决定与发育[2]。Weigel等[3]构建了带有花椰菜花叶病毒启动子35S的LFY表达载体，可在各种组织中活跃表达，在35S：LFY拟南芥植株中，LFY基因的过量表达可以使拟南芥所有侧枝转变为单一的花，并使花期大大提前。Blazquez等[4]将拟南芥LFY基因转入其本身后，转基因植株的侧芽全部转变为花芽，花期提前。但不同植物LFY基因表达也有一定的差异[5]，杨树LFY同源基因导入拟南芥后花期提前，但对杨树自身的转基因植株开花情况影响不明显[6]，而烟草NFLI基因在转入拟南芥后也不能使花期提前[7]。

核桃（Juglans regia L.）属中花发育的研究主要集中在形态观察及生理特性研究，如谢小玉等[8]采用形态学观察和生理生化测定相结合的方法研究了早实核桃与晚实核桃花芽生理分化阶段营养物质含量的差异。而与花发育相关基因在核桃属植物上的报道很少，王正加[9]克隆了山核桃CcLFY基因并利用Real-time PCR技术检测CcLFY在不同部位的表达情况，He等[10]利用RACE技术从早实核桃中林5号中克隆出JrLFY基因的cDNA全长，同时克隆了该基因的DNA全长，并研究了该基因的组织特异性表达[11]。叶春秀等[12]也利用RACE技术克隆了新疆早實核桃早丰的LEAFY同源基因。晚实核桃以顶花芽结果为主，幼树生长较旺，形成花芽少，座果率较低，进入丰产期较晚。为了使晚实核桃提早开花结果，本研究拟克隆JrLFY基因ORF，构建核桃JrLFY基因表达载体，旨在为JrLFY基因转入晚实核桃，为研究基因的缺失、过量表达等打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

中林5号核桃芽采自河北德胜农林科技集团有限公司；农杆菌GV3101购自Biovector Science Lab公司；pRI 101-AN表达载体购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 核桃LFY同源基因的ORF获得 以核桃雄花生理分化期中林5号核桃芽Total RNA为模板，进行逆转录试验。设计引物F和R扩增JrLFY ORF片段，引物序列为：F：5′-ATGGATCCCGACCCCTTTAC-3′；R：5′-TTAGAAGGGCATGTGATCACC-3′。使用TaKaRa LA Taq？誖（Code No.DRR002A）进行PCR扩增，以期得到核桃LFY同源基因的开放阅读框（ORF），然后进行目的片段纯化及测序。

1.2.2 pRI 101-AN·JrLFY表达载体的构建

1）Insert DNA的制备。设计含NdeⅠ/KpnⅠ酶切位点的引物，从含JrLFY基因的ORF质粒中扩增目的基因CDS区片段。设计引物为：CDS1，5′-CACTGTTGATACATATGGATCCCGACCCCTTTACA- GC-3′；CDS2，5′-CAGAATTCGGATCCGGTACCTT- AGAAGGGCATGTGA-3′。使用PrimeSTAR？誖HS DNA Polymerase扩增。取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收特异性条带，将条带命名为Insert DNA。

2）Vector DNA的制备。对pRI 101-AN表达载体进行NdeⅠ/KpnⅠ双酶切，取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收特异性条带，将条带命名为Vector DNA。

3）Insert DNA與Vector DNA的连接。使用In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit，将Insert DNA和Vector DNA连接，连接产物命名为pRI 101-AN·JrLFY，将连接产物取5 μL转化E. coli DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选以及菌落PCR结合的方法得到阳性克隆，提取质粒并测序。

1.2.3 农杆菌GV3101工程菌株的鉴定 将pRI 101-AN·JrLFY表达载体转化农杆菌GV3101感受态细胞，通过浓度均为50 mg/mL的Kan和Rif双抗生素筛选，然后进行菌落PCR检测。

2 结果与分析

2.1 核桃JrLFY基因的ORF获得

根据JrLFY基因cDNA全长序列，设计引物扩增了JrLFY基因完整ORF，取5 μL PCR产物经琼脂糖凝胶电泳获得约1 100 bp的条带（图1）。取 40 μL纯化的PCR产物进行PCR测序，测序结果与JrLFY基因cDNA全长序列一致。

2.2 pRI 101-AN·JrLFY表达载体的构建

2.2.1 Insert DNA的制备 用含NdeⅠ/KpnⅠ酶切位点的引物扩增JrLFY基因CDS区片段，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得一条与预期片段大小一致的条带（图2）。

2.2.2 Vector DNA的制备 pRI 101-AN载体可以将外源基因转化到双子叶植物中，并使外源基因获得高效表达。本研究将pRI 101-AN表达载体进行NdeⅠ/KpnⅠ双酶切，获得Vector DNA片段，与预期片段大小一致（图3）。

2.2.3 构建pRI 101-AN·JrLFY表达载体 利用In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit，将Insert DNA和Vector DNA连接。连接产物pRI 101-AN·JrLFY转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过菌落PCR筛选阳性克隆，质粒测序如图4，该质粒符合试验要求。

2.3 农杆菌GV3101工程菌株的鉴定

通过Kan和Rif双抗生素筛选，获得8个菌落进行PCR检测，第4、5、8号泳道菌落出现目的条带（图5）。为了进一步验证菌落的正确性，将8个菌落摇菌后接种含有Kan和Rif双抗生素液体培养基培养后再进行菌液PCR检测，结果均出现目的条带（图6）。这表明菌液PCR比菌落PCR更灵敏可靠，这应该与摇菌后模板浓度增大有关，同时也说明含有JrLFY目的基因的农杆菌工程菌株筛选成功。根据菌落PCR和菌液PCR的结果，将4号菌落作为工程菌株，所摇的菌液进行分装，-70 ℃保存。

3 讨论

从农杆菌中提取质粒，其拷贝数较低，很难像大肠杆菌那样用酶切鉴定的方法鉴别。因此一般用菌液PCR和菌落PCR扩增进行检测[13]，本研究将获得的8个农杆菌菌落分别作菌落PCR和菌液PCR，结果发现菌液PCR获得目的条带成功率极高，均出现目的条带，这充分说明已成功获得含有JrLFY目的基因的农杆菌工程菌株。

植物基因工程为果树育种开辟了一条新途径，在果树重要性状遗传改良方面具有重要意义，而高效表达载体的构建是其中的重要环节[14]。蔡诚[15]构建了含CaMV35S组成型启动子和卡那霉素筛选基因的RNAi表达载体pBI121+2F，并将其成功的导入农杆菌LBA4404中，石玉等[16]用限制性内切酶SalⅠ、BamHⅠ将已克隆的苹果PGIP基因定向插入到植物表达载体pWR306的ED35s启动子和TNOS终止子中间，成功构建了苹果PGIP基因植物表达载体pWR306-PGIP。但在果树乃至木本植物中植物表达载体很少，核桃中植物表达载体构建更是未见诸报道。

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