重组人β防御素 2工程菌的发酵及纯化研究

张　艳,桑　雪,魏洪涛*,张国利

(1. 吉林大学中日联谊医院 口腔科, 吉林 长春130033；2.军事医学科学院11所)



重组人β防御素 2工程菌的发酵及纯化研究

张艳1,桑雪1,魏洪涛1*,张国利2

(1. 吉林大学中日联谊医院 口腔科, 吉林 长春130033；2.军事医学科学院11所)

摘要：目的发酵并纯化重组人β-防御素2(HBD2)，为其生物活性的检定奠定基础。方法利用罐发酵人β-防御素2工程菌，并建立重组人β-防御素2的层析纯化工艺。结果确定了工程菌优化的最佳发酵条件为高溶氧、低温诱导策略，获得了高密度发酵工艺。建立了重组人β-防御素2的特殊纯化工艺。结论完成了重组人β-防御素2的发酵和纯化工艺研究。

关键词：人β防御素2；工程菌；融合蛋白；发酵；蛋白纯化

(ChinJLabDiagn,2016,20:0362)

人β防御素(HBD)是具有广泛抑菌作用的多肽[1,2],本实验成功构建了BL21(λDE3) TrX-B plysS/pET32a/ TrX-A-HBD2[3]并进行了罐装发酵培养[4]；建立了人β防御素2融合蛋白制备工艺,获得的HBD2结构与原蛋白质结构一致[5]。为人β防御素2重组蛋白实际应用提供材料及佐证。

1材料与方法

1.1材料

原核细胞培养罐(上海保兴)，重组人β防御素 2工程菌(本课题组制备)[1,3]，离心机(贝克曼库尔特)，层析设备及介质(通用公司)，培养基和诱导剂(奥克斯德)，分析纯化学试剂(国产)，肠激酶 (西格玛)。

1.2方法

1.2.1菌种准备将冻存的重组人β防御素 2工程菌复苏，挑单菌，接种于5 ml液体培养基中，经2次对数生长期转接放大备用。

1.2.2罐培养原核细胞培养罐在位消毒后，调整pH值至7.2，罐温37℃后接种，通过调节搅拌转速和通气量维持溶氧在25%左右，发酵进行到OD值≈10时，降低温度至32℃，加入终浓度为1.2 mmol/L的IPTG进行诱导， 6 h后终止发酵并低温离心收集菌体。

1.2.3细菌裂解及盐析细菌裂解采用加入少许硫酸链霉素的冻融方法，细菌充分裂解后离心去除固形物，上清加入固体硫酸铵进行分步盐析。

1.2.4人β防御素 2的粗纯化20%-45%饱和硫酸铵分步沉淀的蛋白组分利用含0.5M NaCl 的Tris-Cl缓冲液重悬后，进行Cu-IMAC阶段层析纯化，收集100-200 mM咪唑洗脱部分。

1.2.5人β防御素 2精纯化利用50 mmol/L Tris-Cl，pH7.5缓冲液平衡G-25层析柱进行样品脱盐，通过测定浓度和体积，计算蛋白质总量，按照50∶1的比率加入肠激酶，于37℃作用3 h，酶切产物再经过金属螯合层析，收集流川峰，即获得HBD2目的蛋白。

2结果

2.1工程菌经过多次罐培养优化后，获得最优罐培养参数：pH7.2，DO为28%，32℃低温长时间诱导，稳定产率为20 g菌体/L左右。

2.2IMAC层析纯化

通过阶段式IMAC层析纯化，电泳结果表明目的蛋白主要存在于100-200 mmol/L咪唑洗脱峰中，见图1。

1:Fusion Protein M:Marker

2.3融合分子的酶切和分离

融合蛋白分子经肠激酶作用后,由21 KD的完整分子被切割成16.5 KD和4.5 KD的两个片段，再经过一次IMAC，4.5 KD的目的片段在流川峰中被洗脱下来，电泳检测纯度达94%左右。

3讨论

由于HBD2具有抑菌作用，利用大肠杆菌表达系统进行HBD2的制备必须要遮蔽它的抑菌作用[3]，所以我们构建了BL21(DE3)TrX-B plysS/pET32a/TrXA- HBD2重组工程菌[4,5]。外源基因的产量表达与每一个细胞浓度及其平均表达产量是成正比例的，为重组蛋白最高产量的获得，依赖于与其相关的多种因素。pET32a作为本实验的表达载体，使用了T7启动子。T7启动子来自T7噬菌体,唯有被T7噬菌体基因1编码的T7RNA聚合酶所识别，要使在T7启动子调控外源基因表达，必须具备可表达T7RNA聚合酶的宿主菌，T7RNA聚合酶是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右[6]。要想获得大量的表达目的蛋白的工程菌，发酵是一个重要途径。由于发酵的很多因素都能影响工程菌的表达量，因此合适的发酵条件非常重要，本实验采用多种参数优化，获得了重组工程菌BL21( DE3)TrX-B plysS/pET32a/ TrXA- HBD2的最优发酵条件并进行了罐装发酵培养。

由于可溶性表达作为本实验的目的蛋白表达方式，这样就方便了纯化，并同时省略了变性和复性的过程，由于添加了His Tag，融合蛋白质分子能够与金属离子发生亲和反应，结合到金属螯合层析介质上，特异性吸附纯化蛋白质，更易纯化目的蛋白，减少了损失，重组HBD2蛋白前添加了具有亲和标记的六个组氨酸，组氨酸具备的咪唑基团既能将电子提供，与金属离子结合，并且不易失活蛋白质，在后续的分离纯化过程中使重组HBD2蛋白仍然保持较高的活性。同时降低了成本，利用肠激酶酶切前后蛋白质分子对金属螯合层析介质的吸附能力差异建立了简便易行的纯化工艺，由于切入了肠激酶，简化了工艺提高了效果。

亲和层析条件温和，操作简单、快速，纯化倍数高，甚至从复杂的蛋白质混合物中一步就可以将纯化的蛋白质分离出来[7]，且活性物质回收率高，有利于含量低又不很稳定的活性物质的分离。因此，本实验中采用自建的纯化工艺对重组蛋白进行纯化，获得了纯度达到94 以上的HBD2蛋白质，为HBD2生物活性检定奠定了基础。

参考文献：

[1]Semple F,Dorin J R.β-defensins：multifunctional mod-ulators of infection,inflammation and more[J]．J Innate Immun,2011,4(4):337.

[2]Semple C A,Gautier P,Taylor K,et al.The changingof the guard:molecular diversity and rapid evolution of beta-defensins [J].Mol Divers,2006,10(4):575.

[3]Hongtao Wei,Xuemei Han, Guoli Zhang,et al.Expression condition optimization and product structure analysis of human β-defensin-2 fusion protein in engineered bacteria[J].Advanced Materials Research,2013,782:1080.

[4]吴剑波,张致平.微生物制药[M].北京:化学工业出版社,2003:144-157.

[5]Hongtao Wei, Guoli Zhang,et al. High expression and preliminary purification of human β-defensin-2 fusion protein[J].Advanced Materials Research,2013,782:1076.

[6]杨喆，李太华，徐维明．大肠杆菌中外源基因表达的研究进展[J]．微生物学免疫学进展，2000，28(2)：69.

[7]李泽鸿,张国利,岳玉环,等.DAB389-(Gly4Ser)2-αMSH重组融合蛋白的构建及表达[J].中国兽医学报,2007,27(4): 477.

The study of the fermentation conditions and purification of recombinant HBD-2

ZHANGYan，SANGXue，WEIHong-tao，etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveOptimizing the fermentation conditions of engineering bacteria fusion protein of HBD-2 and purifying the obtained interest protein to lay a solid foundation for the assay of biological activity of HBD-2 recombinant protein.MethodsEngineering bacteria was ferment under the optimized condition,then collect engineering bacteria to purify and enzyme digest the target protein.ResultsOptimum fermentation condition of engineering bacteriahas been confirmed.The HBD2 fusion protein purification method has been established.ConclusionInterest protein has been obtained after fermentation and purification of HBD2 recombinant engineering bacteria,and recovery rate of interest protein has been enhanced.

Key words:HBD2；engineering bacteria; fusion protein; fermentation;protein purification

(收稿日期：2015-05-16)

作者简介：魏洪涛(1968-)，副主任医师，副教授，硕士生导师，多年从事口腔抗微生物抗肿瘤研究。

文献标识码：A

中图分类号：TQ92

文章编号：1007-4287(2016)03-0362-02

*通讯作者