一株放线菌蓝色素的提取及相关研究

李增政　韦瑶　梁亚平　曹雪莲　肖齐胜

摘 要 从百合鳞茎中发现一株产蓝色素的放线菌，应用发酵和平板培养两种方法生产蓝色素，采用酸碱法提取了该菌的蓝色素粗提物，并对这两种生产所得的蓝色素粗提物分别进行了抑菌活性、温度等的实验，发现该绿色素粗提物对肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等具有拮抗性；在4-60℃温度下平板生产的色素比用发酵生产的色素要稳定。

关键词 蓝色素 抑菌活性 温度 酸碱法 发酵

中图分类号：Q939.9 文献标识码：A

0前言

次级代谢产物是指生物生长到一定阶段后通过次级代谢合成的分子结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是该生物生长和繁殖所必需的小分子物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。色素广泛应用于食品、服装、化妆品等行业，蓝色素作为三种基本颜色之一，可与红、黄色素调配称多种色调，所以开发蓝色素在各个领域中的应用具有很大的现实意义和良好的市场前景。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1目标菌株

从百合鳞茎中分离所得具有产生蓝色素功能的放线菌。

1.1.2 主要试剂和药品

75% 乙醇溶液、大量高温灭菌的蒸馏水、无水乙醇、无水乙酸乙酯、甘油、磷酸氢二钾、硫酸镁、重铬酸钾、制霉菌素、放线菌酮、萘啶酮酸等。

1.1.3主要器材及仪器

9cm培养皿、剪刀，镊子，酒精灯，酒精棉球，移液枪，枪头（蓝色，黄色）、超净工作台、蒸汽灭菌锅、摇床培养箱、1000ml锥形瓶、打孔器、离心机、旋转蒸发仪、冷冻干燥机等。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基及抑菌剂的配制

改良高氏I号：可溶性淀粉 20 g；K2HPO4·3 H2O，0.5 g；MgSO4·7H2O，0.5 g；FeSO4·7H2O，0.01g；KNO31 g；NaCl0.5g；Distilled water1000ml；琼脂18g。

抑菌剂：重铬酸钾（50 g/mL），萘啶酮酸（20 g/mL），放线菌酮（50 g/mL），制霉菌素（50 g/mL）。

发酵种子培养基：可溶性淀粉15g，葡萄糖5g，黄豆粉10g，氯化钠1g，蛋白胨5g，酵母提取物5g，碳酸钙5g，蒸馏水1000ml，PH7。

发酵培养基：黄豆饼粉20g，酵母粉15g，葡萄糖10g， K2HPO4 1g， 碳酸钙3g，氯化钠1g，蒸馏水1000mL，PH7.2左右。

1.2.2放线菌的培养

将所得的目标菌株采用平板划线法划到改良高氏I号固体平板上，置于恒温培养箱中培养，温度为23—26℃。培养5天左右就可以看到平板上的白色菌落，15天左右就可看到平板上有蓝色素产生。

1.2.3发酵

从生长到对数期的平板中挑取一定数量的单个菌落接种于种子培养基中培养，种子培养基于摇床中160r/min培养温度26℃ 培养时间3天左右。种子培养基占发酵培养基的10%。

将活化两天以后的种子培养基接种于发酵培养基中，温度26℃ PH7.2置于160r/min摇床中发酵直至发酵培养基变成蓝绿色为止。（方法一）

1.2.4平板培养法

将该菌采用平板划线法划到改良高氏I号固体平板上，置于培养箱中培养，温度为23—26℃。培养至平板完全变成蓝色为止，然后将平板浸泡在无菌水中带水溶液变成蓝色为止。（方法二）

1.2.5色素提取

提取方法采用酸碱提取法，将发酵液和浸泡液分别调PH至12然后4℃ 4000r离心10分钟：将离心后的上清PH调至1—2，再次4℃ 4000r离心10分钟；最后去上清将沉淀物真空冷冻干燥得到蓝色素粗提物。

1.2.6色素抑菌活性实验

抑菌活性采用滤纸片法滤纸片直径为9mm，溶剂采用三种分别是蒸馏水（1）、99.9%乙醇（2）、乙酸乙酯（3），色素粗提物浓度均为0.003g/ml。操作时将滤纸片浸湿在色素粗提物溶液中然后待风干以后再操作

方法一生产的色素抑菌活性：

方法二生产的色素抑菌活性

1.2.7温度对色素粗提物的影响

方法二所生产的色素：

方法二生产的色素0.1g溶于50ml水中：

方法一生产的色素0.15g溶于50ml水中：

应用两种生产色素方法来生产色素，提取色素粗品以后进行溶解时发现：方法一生产的色素需要将PH调为11—12（起始PH为2.8）才能变成蓝色放置一段时间后溶液会变成黄色，而应用方法二生产的色素溶于水以后溶液直接变成蓝色长时间保存不变色。

2结果及分析

应用两种方法生产所得的色素在色泽上差异很大。方法一所得的色素需要经过调节PH才能呈现蓝色但是暗淡，在常温下放置一段时间后会变成黄色，在热水80€凹？0€耙陨霞尤？0s会变成黄色在温度对色素的影响实验中也发现随着温度升高OD值逐步减小，颜色也越来越淡偏向黄色所以应用该方法所生产的蓝色素不稳定；方法二所得的色素色泽鲜亮蓝色明显，常温下放置不会变色加热到90€耙膊换岜渖琌D值也没有呈现逐步减小，所以方法二所生产的色素相对比较稳定。

在抑菌活性实验中，两种方法所生产的色素均表现出了不同的抑菌活性其中金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、大肠杆菌是两种色素在乙醇和乙酸乙酯溶剂下都有抑菌活性，不同方法生产的色素在不同溶剂中表现出来的抑菌活性有着明显不同，造成这种原因是因为生产方式的不同；而相同色素在相同溶剂下对同一株菌的抑菌活性不同可能是因为色素是粗提物里面物质多样在不同溶剂中表现出了不同溶解度。

基金来源：国家级大学生创新创业训练计划项目《一株产蓝色素放线菌的色素提取及相关研究》项目编号：201610742073。

参考文献

[1] 赵珂，等.攀西地区药用植物内生及根际放线菌的多样性与抗菌活性研究[J]四川大学博士学位论文，2011：74-124.

[2] 沈萍，陈向东.微生物学（第二版）[M].高等教育出版社，1999（10）：79-84.