魁蚶蛋白胰蛋白酶酶解产物的抑菌活性

陈悦　李琦　佟长青　曲敏　李伟

摘要：采用胰蛋白酶对魁蚶蛋白进行不同时间的酶解，比较酶解产物的抑菌活性。选取抑菌活性较好的胰蛋白酶酶解产物进行细菌呼吸抑制研究。通过RP-HPLC对该酶解产物进行分离纯化，采用质谱分析其氨基酸序列。结果表明，胰蛋白酶酶解0.5 h所得到的酶解产物对金黄色葡萄球菌及希瓦氏菌具有较好的抑菌活性。其抑制金黄色葡萄球菌和希瓦氏菌的HMP途径。RP-HPLC分离纯化得到了4个抑菌活性较好的组分。对其中第2组分进行质谱分析得到3个目标多肽，其m/z分别为679、792及905，将这3个目标多肽导入De novo Explorer （TM） Software （AB SCIEX； Version 4.1） 进行分析，获得了候选抑菌肽氨基酸序列。

关键词：魁蚶；酶解产物；抑菌活性；呼吸抑制

抗生素长期使用不仅会使细菌产生抗药性，而且会在动物体内残留，破坏动物肠道内微生物的平衡。寻找一种安全、无残留、无副作用的抗生素替代品成为目前亟待解决的问题。研究表明，抗菌肽具有广谱抗菌活性，可有效抑制细菌、真菌、寄生虫甚至包膜病毒[1-2]。Bolscher等人认为酶解蛋白法制备抗菌肽可能是生产大量抗菌肽最有前途的方法[3]。

魁蚶（Scapharca broughtonii）属软体动物门（Mollusca）、瓣鳃纲（Lamellibranchia）、列齿目（Taxodonta）、蚶科（Arcidae），魁蚶成体个体肥大，肉嫩味美，营养丰富，经济价值很高，是北方沿海地区重要的经济贝类之一[4]。张金铃等研究得到壳聚糖固定化胰蛋白酶对魁蚶肽的制备的最佳工艺[5]。李伟等研究表明魁蚶中含有一种新的具有广谱的抗菌活性的防卫素[6]。目前，已有大量文献报道过贝类抗菌肽，但是对魁蚶抗菌肽研究报道还很少，且未见对魁蚶抗菌肽分子量与氨基酸序列的报道。本研究通过利用胰蛋白酶酶解不同的时间，得到的多种酶解产物，并研究其抑菌活性，以期对魁蚶的开发与利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

魁蚶购于大连市长兴水产品批发市场；革兰氏阴性菌大肠杆菌ATCC35218（E.coli ATCC35218）、产气杆菌（C.perfringens ATCC13124）及革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（S.aureus ATCC25923）及枯草芽孢杆菌（B.subtilis ATCC6633）来自于辽宁出入境检验检疫局、革兰氏阴性菌希瓦氏菌（Shewanella sp.）由农业部暨辽宁省省级高校海洋水产增养殖学与生物技术重点开放实验室惠赠；昆明小鼠血红细胞来自于大连医科大学实验动物中心；Sephadex LH-20、胰蛋白酶购于北京索莱宝科技有限公司；蛋白胨、琼脂粉及牛肉膏购于北京奥博星生物技术有限责任公司；其他试剂均为市售国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 魁蚶肉酶解产物的制备 将去壳后的魁蚶肉，加入等体积的0.9% NaCl后用组织粉碎机匀浆，匀浆后加入2倍体积的0.9% NaCl于4 ℃抽提24 h。抽提液于4 ℃，9 000 r/min条件下离心20 min，弃去沉淀取上清得到可溶性魁蚶蛋白。将得到的可溶性魁蚶蛋白用胰蛋白酶（酶解条件为温度37 ℃，pH=7.4，加酶量为0.5%）酶解0.5、1、1.5、2及2.5 h，酶解后沸水浴5 min使酶失活，然后于4 ℃，9 000 r/min条件下离心20 min，取上清，冷冻干燥，得到魁蚶肉酶解产物。魁蚶肉酶解产物于4 ℃保存备用。

1.2.2 抑菌活性测试 利用滤纸片法按照文献[7]中的方法测定魁蚶肉酶解产物抑菌活性。

1.2.3 呼吸抑制测试 分别取30 mL 0.1 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液、2 mL 1%葡萄糖溶液及2 mL活化后适宜浓度的希瓦氏菌和金黄色葡萄球菌菌悬液，置于测量瓶中不间断剧烈搅拌5 min。将溶氧测定仪传感器置于混合液中，密封后开动磁力搅拌器，每间隔1 min记录一次氧气浓度，记录10 min内平均溶氧浓度（单位：mg O2/L），计算出空白氧气消耗速率。将上述测量瓶中加入200 μL丙二酸溶液（50 mg/mL，Sodium phosphate）测定氧气消耗速率。分别以200 μL磷酸钠溶液（50 mg/mL）、200 μL碘乙酸溶液（50 mg/mL）、200 μL魁蚶肉酶解产物（10 mg/mL）、200 μL磷酸钠溶液与200 μL魁蚶肉酶解产物混合液、200 μL碘乙酸溶液与200 μL魁蚶肉酶解产物混合液及200 μL丙二酸溶液与200 μL魁蚶肉酶解产物混合液，代替丙二酸溶液，测定氧气消耗速率[8]。

按照文献[9-10]中的方法，计算抑菌剂对细菌呼吸抑制率IR，以及典型抑制剂对魁蚶肉酶解产物的叠加抑制率RR。

1.2.4 魁蚶肉酶解产物的分离纯化 选择抑菌活性最好的酶解产物进一步分离纯化。将魁蚶肉酶解产物（胰蛋白酶酶解0.5 h）溶于ddH2O配制成30 mg/mL的溶液，8 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，用0.22 μm水膜过滤，得到样液。使用C18柱，通过P230型高效液相色谱仪分离，检测波长为220 nm，梯度洗脱条件如表1。收集具有抑菌活性的洗脱峰，在通风厨挥发完甲醇后，冷冻干燥，得到魁蚶肉酶解纯化物。

1.2.5 肽分子量测定 利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（5800 MALDI-TOF/TOF）对具有抑菌活性的魁蚶肉酶解产物的RP-HPLC纯化物进行分子量测定。通过正离子模式下选择反射方法对样品测试范围进行校准测试后对样品在正离子模式下选择反射方法测试样品分子量。标准物质校准范围为：1 046.542±05、1 533.858±0.5、2 465.199±0.5及3 494651±0.5。

1.2.6 氨基酸序列测定 氨基酸序列测定利用MALDI-TOF/TOF对RP-HPLC分离纯化得到的魁蚶肉酶解纯化物从头测序（De novo sequencing），首先对多肽样品进行一级质谱（MS）测试，之后选择目标多肽对应母离子进行二级质谱测试（MS/MS），将二级碎片离子数据导入De novo Explorer（TM）Software（AB SCIEX ；Version 4.1）进行分析获得候选肽段氨基酸序列。

2 结果与讨论

2.1 魁蚶肉酶解产物抑菌活性的测定

对胰蛋白酶酶解0.5、1.0、1.5、2.0及2.5 h得到的魁蚶蛋白酶解产物进行抑菌活性测定。从表2中可以看出，酶解0.5 h的酶解产物抑菌活性较好，能抑制产气杆菌、金黄色葡萄球菌及希瓦氏菌。此外，不同时间的酶解产物均能抑制金黄色葡萄球菌，酶解1.0、1.5及2.0 h对希瓦氏菌也有较弱的抑制活性。

2.2 呼吸抑制测定

通过观察丙二酸、碘乙酸及磷酸钠三种典型的糖代谢抑制对细菌的呼吸抑制率以及样品与这3种抑制剂组合后的呼吸抑制率，可以得出样品对细菌的呼吸代谢抑制途径[8，11]。如表3所示，胰蛋白酶酶解0.5 h的酶解产物与金黄色葡萄球菌和希瓦氏菌共存时，均表现出对希瓦氏菌呼吸代谢的抑制效应，且均与磷酸钠组成的组合抑制剂叠加抑制率最低，抑制金黄色葡萄球菌和希瓦氏菌糖氧化代谢途径的HMP途径。

2.3 RP-HPLC分离纯化及抑菌活性的测定

将胰蛋白酶酶解0.5 h的酶解产物通过RP-HPLC直接进行分离纯化，并对其中的部分峰进行抑菌活性实验。实验结果如图1所示。

利用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）对峰2进行从头测序（De novo sequencing）。首先对峰2样品进行一级质谱（MS）测试，之后选择目标多肽对应母离子进行二级质谱测试（MS/MS），共得到3个目标多肽，其m/z分别为679、792、905。然后将这3个目标多肽的二级碎片离子数据导入De novo Explorer（TM）Software（AB SCIEX ；Version 4.1）进行分析获得候选氨基酸序列。结果如表5所示，m/z为679、792、905的多肽，得分70分以上的候选氨基酸序列分别为2、5、5个。

3 结论

胰蛋白酶酶解魁蚶蛋白酶解产物的抑菌活性较好。其中胰蛋白酶酶解0.5 h的酶解产物对产气杆菌、希瓦氏菌抑菌活性都较好，对金黄色葡萄球菌也表现出抑菌活性。对呼吸抑制的研究表明，胰蛋白酶酶解0.5 h的酶解产物对希瓦氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制都是通过抑制其糖氧化代谢的HMP途径。对魁蚶肉酶解产物凝集活性进行测试结果显示，胰蛋白酶酶解魁蚶肉的酶解产物的细菌凝集活性与其抑菌活性没有直接关系。将胰蛋白酶酶解0.5 h的酶解产物通过RP-HPLC分离纯化得到4个活性组分，测得峰2分子量792.59。对峰2进行进一步研究，得到3个目标多肽，将这3个目标多肽导入De nov Explorer（TM）Software（ABSCIEX ；Version 4.1）进行De nove测序分析，得到候选氨基酸序列。

参考文献：

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[2] Hoang VLT，Kim SK.Antimicrobial peptides from marine sources [J].Current Protein and Peptide Science，2013，14（3）：205-211

[3] Bolscher JGM，van der Kraan MIA，Nazmi K，et al.A one-enzyme strategy to release an antimicrobial peptide from the LFampin-domain of bovine lactoferrin [J].Peptides，2006（27）：1-9

[4] 王颖，吴志宏，李红艳，等.不同地理群体魁蚶的营养成分比较研究[J].食品科学，2013，34（3）：248-252

[5] 张金铃，迟海，李伟，等.壳聚糖固定化胰蛋白酶制备魁蚶肽的研究[J].水产科学，2010，29（9）：553-555

[6] 李伟，金桥，姬文婷，等.魁蚶防卫素分离纯化及其抑菌作用的研究[J].食品工业科技，2010（9）125-129

[7] 李伟，陈文，佟长青，等.菲律宾蛤仔凝集素的分离纯化及抑菌活性研究[J].大连海洋大学学报，2012，27（4）：333-337

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[10] 陈亚非，黄凯玲，高健华，等.α-溴代肉桂醛及烷烯基酸酯类对鲜草菇呼吸代谢的抑制[J].食品科学，1994，（9）：9-12

[11] 汪海洪，包杰中，宁正祥，等.富马酸二甲酯对微生物生长和呼吸的抑制作用[J].食品与发酵工业，1993，12（2）：1-6

Abstract：Scapharca Broughtonii proteins were digested using trypsin for different time， and the antibacterial activities of the obtained hydrolysates were investigated.Inhibition of respiration was carried out using the hydrolysates with stronger antibacterial activities.The hydrolysates were isolated and purified on RP-HPLC column， and the amino acid sequences were analyzed by mass spectrometry.The results showed that the hydrolysates digested by typsin for 0.5 h could better inhibit the growth of Staphylococcus aureus and Shewanella sp.They inhibited Hexose Monophophate Pathway （HMP） of S.aureus and Shewanella sp.Four fractions with better antibacterial activities were isolated and purified on RP-HPLC column.Three peptides found in the 2nd fraction were analyzed by MS/MS， and their m/z were 679， 792 and 905， respectively.The three peptides were analyzed using De novo Explorer （TM） Software （AB SCIEX； Version 4.1） and the candidate amino acid sequences were obtained.

Key words：Scapharca Broughtonii； Enzymatic hydrolysate； Antibacterial acitivity； Inhibition of respiration