重组猪α干扰素工程菌的诱导表达及产物纯化

沈继朵　王聪　张莉　栗俞程

摘要：为获得大量猪α干扰素的重组蛋白，研究了其发酵条件，并对目的蛋白进行分离纯化。考察了不同IPTG诱导浓度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mmol/L）、不同诱导温度（17、27、32、37 ℃）、不同诱导时间（0、2、3、4、5、6、7、8 h）对目的蛋白表达的影响;同时对包涵体进行提取、溶解变性进行研究，最后采用Ni柱亲和层析纯化目的蛋白。采用SDS-PAGE电泳及Image Pro Plus 6.0软件分析电泳结果，结果显示，IPTG诱导浓度为 1.0 mmol/L、诱导温度为27 ℃、诱导时间为6 h时，目的蛋白表达量最多;超声波破碎细菌的最优时长循环为10 s/10 s;8 mol/L尿素溶解包涵体过夜可得到大量可溶性目的蛋白含量，Ni柱亲和层析后可去除大量杂蛋白，获得较纯的目的蛋白。可见本试验通过优化重组猪α干扰素诱导表达条件及纯化方法，获得了高表达、高纯度的重组猪α干扰素蛋白，为今后研究其生物活性奠定了初步基础。

关键词：猪α干扰素;工程菌;诱导表达;包涵体;纯化

中图分类号：S188 文献标志码： A

文章編号：1002-1302（2019）09-0214-04

干扰素（interferon，IFN）是动物细胞在受到某些病毒感染后，分泌的一种具有抗病毒功能的宿主特异性糖蛋白。通常根据产生干扰素的细胞不同将其分为Ⅰ、Ⅱ型干扰素，Ⅰ型干扰素主要包括α、β等6种，是由微生物、病毒等诱导产生，而Ⅱ型干扰素主要包括γ干扰素[1]。猪α干扰素是一种广谱抗病毒药，对猪的轮状病毒腹泻、流行性腹泻、传染性胃肠炎等病毒有较好的疗效，可用于防治猪病毒性疾病[2]。传统猪α干扰素表达量低、时间长，无法满足防治疾病的要求，因而采用基因工程体外表达生产IFN-α，重组猪α干扰素是将猪α干扰素基因重组质粒导入大肠埃希菌原核表达系统中[3]。目前，含有猪α干扰素基因的重组质粒在大肠杆菌中如何高表达，如何获得纯度较高的α干扰素一直是研究领域的急需解决的一个问题。因此，本研究以表达猪α干扰素的基因工程重组大肠埃希菌BL21（DE3）为试验对象，主要考察了不同IPTG浓度、不同诱导温度、不同诱导时间对目的蛋白含量的影响，并进一步地研究如何将以包涵体形式存在的目的蛋白溶解，最后通过Ni柱亲和层析纯化了目的蛋白，旨在为后续研究重组猪α干扰素的生物活性及产业化开发奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

重组大肠埃希工程菌BL21（DE3）/pET-32a-IFNα，购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 试剂

彩虹245广谱蛋白Marker、双色预染Marker、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、IPTG、氨苄青霉素（Amp）、尿素、盐酸胍购自北京索莱宝科技有限公司;His标签蛋白纯化试剂盒（包涵体蛋白）购自康为世纪生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.3 重组猪α干扰素工程菌的诱导表达

1.3.1 不同浓度IPTG对目的蛋白表达量的影响 用接种环从-80 ℃保藏的工程菌甘油管中蘸取菌液1环，在含有Amp的LB固体平板上采用分三区划线的方法进行划线接种，37 ℃ 过夜恒温培养16 h。无菌操作挑取工程菌的单菌落，放入含5 μL Amp（终浓度为100 μg/mL）的5 mL液体培养基LB中，37 ℃、150 r/min过夜振荡培养15 h。按1%的接种量分别接入7瓶含5 μL Amp（终浓度为100 μg/mL）的5 mL液体培养基LB中，另外1瓶按1%的接种量接入含6 μL Amp（终浓度为100 μg/mL）的6 mL液体培养基LB中，均于 37 ℃、150 r/min恒温振荡培养至D600 nm约0.6时。从6 mL的LB液体培养基中，取出1 mL菌液作为未诱导对照。然后在8瓶都含有 5 mL LB液体培养基中，加入诱导剂IPTG，使IPTG终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mmol/L，37 ℃、150 r/min振荡培养6 h。6 h后每瓶分别取出1 mL菌液，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清，留菌体沉淀。沉淀用80 μL双蒸水吹散，加入20 μL 5×Loading Buffer，使样品缓冲液和蛋白样品充分混匀，然后将其置于沸水浴中煮沸 10 min。取上清10 μL进行12% SDS-PAGE检测表达量与IPTG浓度之间的关系。

1.3.2 不同浓度IPTG对目的蛋白表达量的影响 按“2.1.1”节的方法活化工程菌，挑取活化后的单菌落，放入含5 μL Amp（终浓度为100 μg/mL）的5 mL液体培养基LB中，37 ℃、150 r/min 过夜振荡培养15 h。按1%的接种量分别接入4瓶含5 μL Amp（终浓度为100 μg/mL）的5 mL液体培养基LB中;于37 ℃、150 r/min恒温振荡培养至D600 nm约0.6时，每瓶培养液中分别加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，然后将4瓶菌液分别放入17、27、32、37 ℃ 4个不同温度的恒温摇床中，150 r/min振荡培养6 h。然后各取1mL菌液，菌液离心，样品处理方法同“1.3.1”节中步骤，取上清10 μL进行12% SDS-PAGE检测表达量与诱导温度之间的关系。

1.3.3 不同诱导温度对目的蛋白表达量的影响

按“1.3.1”节的方法活化工程菌，挑取活化后的单菌落，放入含5 μL Amp（终浓度为100 μg/mL）的5 mL液体培养基LB中，37 ℃、150 r/min 过夜振荡培养15 h。按1%的接种量分别接入含10 μL Amp（终浓度为100 μg/mL）的10 mL液体培养基LB中;于37 ℃、150 r/min恒温振荡培养至D600 nm约0.6时，在培养液中加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，取出1 mL作为未诱导对照。然后将菌液于27 ℃、150 r/min条件下振荡培养，分别于2、3、4、5、6、7、8 h各取1 mL菌液，菌液离心，样品处理方法同“1.3.1”节中步骤，取上清10 μL进行12% SDS-PAGE检测表达量与诱导时间之间的关系。

1.4 重组猪α干扰素蛋白的分离纯化

1.4.1 不同超声时间间隔对菌体破碎的影响

按“1.3.1”节的方法活化工程菌，挑取活化后的单菌落将放入含5 μL Amp（终浓度为100 μg/mL）的5 mL液体培养基LB中，37 ℃、150 r/min过夜振荡培养15 h。按1%的接种量分别接入含150 μL Amp（终浓度为100 μg/mL）的150 mL液体培养基LB中;于37 ℃、150 r/min恒温振荡培养至D600 nm约0.6时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，于27 ℃、150 r/min振荡培养6 h。取50 mL菌液，共3管，于4 ℃，8 000 r/min离心 20 min，弃上清，得到菌体。称取菌体细胞的湿质量，按每 100 mg 菌体加入2 mL细菌蛋白萃取剂（含20 μL蛋白酶抑制剂），混合均匀，平均分到3管中，于4 ℃，功率30%，超声波破碎时间间隔分别设置为5 s/5 s、3 s/3 s、10 s/10 s，破碎细胞20 min，然后4 ℃、8 000 r/min离心20 min，分离上清和沉淀，收集上清和沉淀，处理样品后进行SDS-PAGE电泳，确定最佳超声破碎菌体的时间。

1.4.2 不同条件溶解包涵体

按“1.3.1”节步骤得到的包涵体沉淀用5 mL 0.01 mmol/L的PBS磷酸盐缓冲液吹散沉淀，洗涤菌体，采用4 ℃、8 000 r/min离心15 min，弃上清，留沉淀，重复此步骤2次。包涵体沉淀分别采用以下3种方式处理：（1）5 mL的Binding Buffer缓冲液（48 g尿素，0.5 mL Imidazole，16.7 mL NaCl，2 mL Tris-HCl，pH值7.9）重悬沉淀;（2）5 mL的6 mol/L盐酸胍溶液重悬沉淀;（3）用5 mL的 8 mol/L 尿素溶液重悬沉淀;3种方法均采用超声破碎10 min使其充分混匀，分别4 ℃过夜，然后8 000 r/min、4 ℃离心 20 min，分离收集上清和沉淀，处理样品后进行SDS-PAGE电泳，确定最佳溶解包涵体的条件。

1.4.3 Ni柱亲和层析纯化目的蛋白

取诱导表达后的菌液离心收集菌体，采用10 s/10 s超声条件超声，采用8 mol/L尿素溶液过夜重悬包涵体沉淀使至溶解，然后溶解后的目的蛋白进行Ni柱亲和层析纯化，按照His标签蛋白纯化试剂盒（包涵体蛋白）说明书进行操作。用1.5 mL EP管分别收集Binding Buffer缓冲液冲洗层析柱的液体，Elution Buffer缓冲液洗脱层析柱的液体，每管约1 mL左右。挑取收集的样品，处理样品后进行SDS-PAGE电泳，方法同“1.3.1”节。

2 结果与分析

2.1 重组猪α干扰素工程菌的诱导表达

2.1.1 不同IPTG浓度对目的蛋白表达的影响

构建的重组α干扰素的分子量约为19 ku，从图1左图可以看出，在 19 ku 处，泳道10无目的蛋白，其余不同浓度IPTG均能诱导出目的蛋白，然后采用Image Pro Plus 6.0分析软件对不同诱导浓度下的目的蛋白浓度进行分析，结果如图1柱状图所示，IPTG浓度为1.0 mmol/L时，目的蛋白含量最高，因此，在后续试验中选择1.0 mmol/L作为最佳诱导浓度。

2.1.2 不同诱导温度对目的蛋白表达的影响

根据不同IPTG浓度对目的蛋白表达的影响试验中结果，采用 1.0 mmol/L IPTG诱导目的蛋白表达，重组α干扰素的分子量约为19 ku，从图2左图可以看出，在17、27、32、37 ℃不同温度下有诱导出目的蛋白，然后采用Image Pro Plus 6.0分析软件对不同诱导温度下的目的蛋白浓度进行分析，结果如图2右图所示，诱导温度为27 ℃时，目的蛋白含量最高，因此，在后续试验中选择27 ℃作为最佳诱导温度。

2.1.3 不同诱导时间对目的蛋白表达的影响

根据不同IPTG浓度和不同温度对目的蛋白表达的影响试验中结果，采用1.0 mmol/L IPTG，诱导温度27 ℃，诱导目的蛋白表达，重组α干扰素的分子量约为19 ku，从图3左图可以看出，在 2、3、4、5、6、7、8 h有诱导出目的蛋白，然后采用Image Pro Plus 6.0[CM（24*8]分析软件对不同诱导时间下的目的蛋白浓度进行分析，结果如图3右图所示，诱导时间为6 h时，目的蛋白含量最高，因此，在后续试验中我们选择6 h作为最佳诱导时间。

2.2 重组猪α干扰素蛋白的分离纯化

2.2.1 不同的超声时间间隔对菌体破碎的影响

采用不同的超声条件裂解菌体，获得更多的目的蛋白，如图4所示，菌体经超声裂解后，目的蛋白主要以包涵体形式存在沉淀中，上清中可溶行目的蛋白含量很少，在3种条件下，得到包涵体含量差异不明显，所以为了能更多地裂解菌体得到包涵体，后续试验采用10 s/10 s超声条件。

2.2.2 不同条件溶解包涵体

為了使目的蛋白以可溶性形式存在，采用3种不同条件溶解包涵体，溶解后取上清SDS-PAGE电泳。从图5、图6中可见，溶解后上清中蛋白含量较少，用盐酸胍溶解包涵体后，目的蛋白仍主要以包涵体的形式存在;而采用8 mol/L尿素溶液过夜溶解包涵体，上清中可溶性的目的蛋白较多，包涵体基本被溶解变性，以可溶性的形式存在于溶液中（图7），可用于后面的分离纯化。

2.2.3 Ni柱亲和层析纯化目的蛋白

重组猪α干扰素工程菌在IPTG浓度为1.0 mmol/L，诱导温度27 ℃，诱导6 h后，

目的蛋白含量最高，菌体经采用10 s/10 s超声裂解，用 8 mol/L 尿素溶液溶解包涵体，目的蛋白以可溶性的形式存在于溶液中，猪α干扰素重组质粒带有His标签，采用His标签蛋白纯化试剂盒（包涵体蛋白）对可溶性的目的蛋白进行纯化，去除杂蛋白，分别取样品流出液、清洗液以及洗脱液电泳。从图8可以看出，经过Ni柱纯化，大部分杂蛋白可以去除，得到较纯的可溶性的目的蛋白。

3 讨论

干扰素是细胞受到病毒或其他诱生剂的诱导分泌的糖蛋白，是细胞内的一种重要细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学活性。由于传统干扰素表达量低、时间长，无法满足防治疾病的要求，因而采用基因工程方法制备重组的干扰素，目前所知的重组干扰素表达系统主要有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、动物细胞表达系统等[4-6]。其中研究较为深入的是大肠杆菌表达系统，该系统具有培养条件简单、易操作、培养周期较短、成本相对低、产量高、易于规模化等有优点，但也存在其不足之处——表达的蛋白常以包涵体的形式存在，需要对其进行变性、复性处理。外界表达许多条件对重组蛋白的表达具有重要的影响。大肠杆菌是利用乳糖操纵子作为启动子表达下游基因，需要乳糖作为诱导物进行诱导，但是因为大肠杆菌可利用乳糖，所以，目的基因表达不能够被持续诱导。而IPTG结构上与乳糖相似，可以代替乳糖且不会被大肠杆菌利用，外源基因也可以持续表达，但是不同诱导浓度对目的蛋白表达量有影响。另外诱导温度对目的蛋白表达也有重要影响，高温不利于蛋白结构的形成，温度太低不利于菌体生长，影响外源蛋白表达量;诱导时间的长度对目的蛋白的表达也具有至关重要的作用，随着时间的推迟，目的蛋白也可能被酶降解[7]。本研究首先对不同IPTG浓度、诱导温度、诱导时间进行摸索，以期找到最佳的目的蛋白表达条件。通过SDS-PAGE的凝胶电泳最终确定使目的蛋白表达最高的最适IPTG浓度为1.0 mmol/L，最适温度为27 ℃，最适诱导时间为6 h。

为了使目的蛋白充分从菌体中释放出来，本研究采用超声波破碎法提取目的蛋白，超声波破碎法利用声波在液体介质中形成很多小气泡，当小气泡炸裂，会产生很强的能量以及热量，从而起到破碎细胞等物质的作用[8]。本研究对比了不同的超声时间间隔（5 s/5 s，3 s/3 s，10 s/10 s）对菌体破碎的影响试验，试验结果显示上清比沉淀的条带颜色浅得多，目的蛋白主要以不溶性包涵体形式存在于沉淀中，在3种条件下得到包涵体沉淀量无明显差异，最终为了让菌体裂解充分，选择在10 s/10 s条件下裂解菌体。

包涵体是一种不溶性的蛋白质颗粒，一般是由于表达的蛋白合成速度太快，进行错误折叠，形成错配二硫键，彼此之间非特异性结合，没有达到足够的溶解度，从而形成沉淀。需要对沉淀中的包涵体作出变性处理，使之溶解在上清中，才能进行最后的纯化试验[8]。首先采用包涵体提取试剂盒中的Binding Buffer缓冲液溶解包涵体，可以看出上清中条带的颜色非常浅，说明包涵体未充分溶解;采用盐酸胍溶解包涵体，可以看出，整个图片的条带都是扭曲的，这是由于盐酸胍电泳时与SDS结合形成沉淀，造成蛋白无法进行SDS-PAGE电泳以及亲和层析，否则会损坏层析柱，且蛋白上的盐酸胍无法有效除去。故采用8 mol/L尿素过夜溶解包涵体，试验结果可以很明显地看出，尿素溶解后的上清目的蛋白条带颜色很深，说明尿素处理后可溶性的目的蛋白含量较多，而沉淀中目的蛋白含量却很少，因此，最終采用8 mol/L尿素过夜溶解包涵体，为后续纯化奠定基础。

重组大肠埃希工程菌[BL21（DE3）/pET-32a-IFNα]His（组氨酸）标签，采用了Ni柱亲和层析纯化目的蛋白[9]。在试验过程中，当尿素和Binding Buffer混合液通过层析柱时，带有His标签的目的蛋白就会与镍离子吸附而滞留在层析柱中。而杂蛋白不会被吸附，直接流出，就可以与目的蛋白分开，然后用含有较低咪唑浓度的Binding Buffer缓冲液（His标签与镍离子的结合力没有咪唑与镍离子的结合力强）将与柱子结合不紧密的杂蛋白洗脱下来，再用含有较高咪唑浓度的Elution Buffer洗脱液将结合紧密的目的蛋白洗脱下来，采用此种方法蛋白纯度可以达到相对较高的程度。试验结果显示，泳道2、3是尿素和Binding Buffer缓冲液混合后过柱子流出的，目的蛋白结合在柱子上，杂蛋白没结合上去，因此洗掉很多杂蛋白。泳道4、5、6是Binding Buffer缓冲液洗脱柱子后流出的，而杂蛋白在前面已经被洗掉，因此此处的杂蛋白含量少（有部分杂蛋白也结合在柱子上，但连接不紧密），条带颜色有些淡。又因为用于过柱子的蛋白比较多，所以此处有些未结合在柱子上的目的蛋白被洗脱下来。泳道7、8、9是Elution Buffer洗脱液洗脱下来的蛋白，可以看出目的蛋白很多，杂蛋白很少，蛋白纯度相对较高，实现纯化目的蛋白的目的。

综上，本研究使目的蛋白表达量最多的IPTG诱导浓度为1.0 mmol/L、诱导温度为27 ℃、诱导时间为6 h;超声波破碎细菌的最优时长循环为10 s/10 s;8 mol/L尿素溶解包涵体过夜可得到大量可溶性目的蛋白含量，Ni柱亲和层析后可去除大量杂蛋白，为后续研究重组猪α干扰素的生物活性及产业化开发奠定了基础。

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