布鲁氏菌S2株菌壳的制备研究＊

刘 爽，刘 军，2，何永聚，祝令伟，2，孙 洋，2，周 博，2，纪 雪，2，冯书章，2

布鲁氏菌（Brucellaspp．）是一种重要的胞内寄生性人兽共患病原菌。它的流行范围广，传染性强。布鲁氏菌抵抗力较强，在土壤、毛皮、病畜的脏器及其分泌物中可生存数周至数月，人及家畜均易感［1］。布鲁氏菌可引起人、家畜及其他动物的布鲁氏菌病。布病是一种家畜和野生动物均能感染的传染病，主要症状为发热、流产、不育、慢性关节炎及神经损害等，主要能引起怀孕的雌性动物在怀孕后期流产，以及雄性动物的睾丸炎和附睾炎。布鲁氏菌病严重危害人类健康和畜牧业发展，导致世界范围内的严重经济损失和公共卫生问题［2］。

近年来，菌壳（Bacterial ghosts）正作为一种新型候选疫苗，应用于许多种革兰氏阴性细菌的研究中［3］。它是在导入细菌细胞内的噬菌体PhiX174裂解基因E表达后，在细菌表面形成跨膜孔道，通过跨膜孔道，内容物如核酸、核糖体等即可流出细胞，从而形成细菌空壳［4］。这种方法是以非变性方法来灭活细菌，使菌体保持了原始细胞的表面抗原结构，外膜的这些天然结构使菌壳自身具有内在的佐剂活性［5］，对增强由外膜抗原引起的免疫应答起重要的作用。此外，可以利用细菌在外膜表达外源抗原，再经蛋白E裂解成菌壳，免疫后菌壳能将内源性和外源性抗原同时递呈给免疫系统，因此可将菌壳制备成为疫苗递送载体［6］，以此来加强机体免疫反应。

布鲁氏菌S2株是一种弱毒疫苗，对猪、牛和羊均能产生较好的免疫，在我国被广泛使用。但由于其属于弱毒活菌疫苗，仍然具有一定的毒力，且存在着返祖的可能性。为了开发安全性更高、保护效力更好的布鲁氏菌疫苗，本研究将pBV220∶∶E质粒中的温度敏感启动阻遏系统和裂解基因E融合片段λpL／pR－cI857－E 克隆至载体 pBBR1MCS－2上，通过改变温度，控制裂解基因E在重组菌S2（pBBR1MCS－E）中的表达，制备了布鲁氏菌S2菌壳，为布鲁氏菌菌壳疫苗的开发奠定了基础。

1 材料和方法

1．1 材料 重组质粒pBV220：：E由本实验室构建［7］；pBBR1MCS－2由路易斯安那州立大学医学中心Kovach教授惠赠［8］；布鲁氏菌S2株由本室保存；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen生物技术有限公司；T4DNA连接酶、DL2000DNA Marker购自大连宝生物工程有限公司。

1．2 温控调节盒和裂解基因E的PCR扩增 根据pBV220∶∶E上温控调节盒λpL／pR－cI857和裂解基因E的编码序列设计两条引物BRU1：5′－cc act agt att acc gcc ttt gag tga－3′和 BRU2：5′－cc gtc gac tca ggagag cgt tca cc－3′，上下游引物5′端分别引入限制性酶切位点SpeI和SalI。以重组质粒pBV220∶∶E为模板，按照以下条件进行PCR扩增：94℃预变性2min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环后，72℃延伸10 min。以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。回收纯化PCR产物，即温控调节盒和裂解基因E的融合片段PL／PR－E。

1．3 温控调节重组质粒pBBR1MCS－E的构建将pBBR1MCS－2质粒进行SpeI和SalI双酶切，将酶切后的质粒片段纯化回收，用T4DNA连接酶将其与PL／PR－E片段于4℃过夜连接。再将连接产物电转化（2 500kV，5ms）至大肠杆菌DH5α，转化后菌液涂布于含有卡那霉素（100μg／mL）的脑心培养基平板，28℃过夜培养。挑取单菌落接种于5 mL LB培养液（Kan 100μg／mL），28℃培养后提取质粒，用限制性内切酶SpeI和SalI进行双酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒即为热敏裂解质粒pBBR1MCS－E。

1．4 重组布鲁氏菌S2（pBBR1MCS－E）的构建与菌壳的制备 将热敏裂解质粒pBBR1MCS－E电转化至布鲁氏菌S2菌株，涂布于脑心培养基（Kan 100 μg／mL）平板，挑取单菌落于5mL脑心培养液（Kan 100μg／mL），28℃振荡培养过夜，通过PCR扩增E基因鉴定重组菌株。将鉴定正确的重组菌株S2（pBBR1MCS－E）接种于脑心培养液，28℃摇床培养至OD600值约为1．5，迅速升温至42℃诱导培养2d后离心收集沉淀，再以生理盐水洗涤即得菌壳。

1．5 重组布鲁氏菌S2（pBBR1MCS－E）溶菌动力学实验 将布鲁氏菌S2（pBBR1MCS－E）接种于脑心培养液（Kan 100μg／mL），次日将细菌转接入2瓶脑心培养液（Kan 100μg／mL）中，28℃振荡培养至OD600约为1．5。其中一瓶于28℃继续培养，另一瓶转移至42℃诱导培养。另接种布鲁氏菌S2于脑心培养液中，在28℃振荡培养作为对照。间隔6 h监测OD600值，绘制布鲁氏菌S2生长曲线和菌壳的裂解曲线。

1．6 溶菌质粒pBBR1MCS－E对布鲁氏菌S2的裂解率测定实验 将诱导前和诱导结束后的菌液分别以适当倍数稀释，涂于脑心培养基（Kan 100μg／mL）平板，28℃恒温箱培养2d，计算活菌数（cfu／mL），重复3次取平均值。计算出重组质粒pBBR1MCS－E对布鲁氏菌S2的裂解率。裂解率＝（1－诱导后cfu／诱导前cfu）×100%。

1．7 布鲁氏菌S2菌壳形态学观察 将28℃培养的布鲁氏菌和42℃诱导培养制备的S2菌壳离心，用生理盐水洗涤3次并重悬，染色固定后用透射电镜进行观察。

2 结 果

2．1 温控调节盒λpL／pR－cI857和裂解基因 E 融合片段的PCR扩增 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳见图1所示，结果扩增出了与预期大小一致的片段。

2．2 热敏溶菌质粒pBBR1MCS－E的鉴定 将温控调节盒和裂解基因E融合片段克隆到质粒pBBR1MCS－2中，再进行双酶切鉴定。酶切产物电泳结果如图2所示，说明热敏裂解质粒pBBR1MCS－E构建正确。

2．3 重组布鲁氏菌S2（pBBR1MCS－E）的鉴定 将热敏溶菌质粒pBBR1MCS－E电转化到布鲁氏菌S2后，PCR鉴定重组菌结果如图3所示，与预期结果一致，说明温敏裂解质粒pBBR1MCS－E已经成功转化至布鲁氏菌S2中。

2．4 重组布鲁氏菌S2（pBBR1MCS－E）溶解动力学实验 布鲁氏菌S2和重组菌株S2（pBBR1MCSE）的生长曲线和裂解曲线见图4所示。结果显示热敏溶菌质粒pBBR1MCS－E对布鲁氏菌S2有很高的裂解效率。42℃条件下诱导约6h后OD600达到峰值，之后逐渐下降。而28℃培养条件下的重组菌S2（pBBR1MCS－E）与布鲁氏菌S2生长曲线一致。

图4 布鲁氏菌S2和重组菌S2（pBBR1MCS－E）的生长曲线和裂解曲线Fig．4 Growth and lysis curves of Brucella S2and recombinant S2（pBBR1MCS－E）The arrow indicates bacterial cultures were shifted from 28℃to 42℃．

2．5 溶菌质粒pBBR1MCS－E对布鲁氏菌的裂解效率 根据诱导前和诱导结束后的菌液计算活菌数（cfu／mL），重组质粒pBBR1MCS－E对布鲁氏菌S2的裂解率为（1－3．65×105／5．85×109）×100% ＝99．99%。

2．6 电镜观察布鲁氏菌S2菌壳形态 电镜观察结果如图5所示，布鲁氏菌菌壳保持着细菌的基本细胞形态，但由于细胞内容物外流而使细胞变形，细胞表面发生明显皱缩。

图5 电镜观察布鲁氏菌S2和菌壳的形态Fig．5 Morphology observation of BrucellaS2（A and B）and Brucellaghosts（C and D）under the electron microscope

3 讨 论

控制和预防布鲁氏菌病的最好方法就是使用疫苗，迄今国内外已有多个布鲁氏菌疫苗在使用，如兽用减毒活疫苗有S19、104M、S2、M5、牛种布鲁氏菌45／20、羊种布鲁氏菌 H38等，人用活疫苗主要有19－B和104M等。虽然这些疫苗都具有一定保护效力，但均有副作用大的缺点。

菌壳这一新型的细菌性疫苗，正广泛的应用于预防细菌性传染病的研究。菌壳具有原始的细胞形态和天然表面抗原，其失活过程不会引起细菌表面结构任何的物理变性和化学变性。菌壳内在的佐剂活性能增强针对外膜抗原的免疫应答，包括对T细胞的激活作用和粘膜免疫［9］。通过基因工程方法对细菌表面成分进行改造后，菌壳的作用还可大为拓展，是很好的多联疫苗预备株。虽然目前还没有菌壳疫苗被用于临床，但已有多种细菌被制备成了菌壳，包括出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E．coli）［10］、致病性大肠杆菌（Enteropathogenic E ．coli）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）［11］、Edwardsiella tarda［12］、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）［13］等，这 些 研究均表明细菌菌壳具有良好的安全性和免疫保护作用，可作为预防细菌性传染病的候选疫苗。为了研究利用布鲁氏菌菌壳作为疫苗来预防布病的可行性，本研究利用噬菌体裂解蛋白E制备了布鲁氏菌菌壳。

为了制备布鲁氏菌菌壳，本研究使用了pBBR1MCS－2质粒。该质粒的宿主范围广，已经被证实可以在多种细菌中复制，如百日咳杆菌（Bordetellaspp．）、布鲁氏菌（Brucellaspp．）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、恶臭假单胞菌（P．putida）、球 形 红 假 单 胞 菌 （Rhodobacter sphaeroides）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）等。通过对该质粒进行改造，加入了温控表达调节系统λpL／pR－cI857和裂解基因E，成功构建了重组质粒pBBR1MCS－E，并利用该重组质粒制备了布鲁氏菌菌壳，裂解完成的菌壳再通过高渗溶液中冻融，即可完全清除其中残存的活菌，达到100%灭活的效果。本研究成功制备了布鲁氏菌这一胞内病原菌的菌壳，为下一步进行该菌壳作为疫苗的可行性研究奠定了基础，也为研制胞内病原菌疫苗提供了新的思路和技术路线。

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