浙江省副溶血性弧菌污染水平及贝类海产品风险评估

梅玲玲，潘雪霞，朱 敏，张俊彦，龚 璞，潘军航，占 利

副溶血性弧菌（Vibrio par ahaemol yticus，VP）又称致病性嗜盐菌、肠炎弧菌，主要生存于近岸海水和鱼贝类等海产品中［1－3］。自1951年藤野等报告该菌以来，许多国家相继有病例报道，至今已成为沿海国家或地区的重要食物中毒和夏季腹泻的重要病原菌之一。日本每年由本菌引起的食源性疾病占细菌性食源性疾病的40%～60%［4］。中国位居食源性疾患的前3位。

浙江省是一个沿海省份，有着广阔的海域和丰富的水产品，本地居民爱吃海产品，历来有生食或半生食贝类、甲壳类等海产品的习惯。并且，随着外来饮食文化的影响，生食半生水食产品现象为我省越来越多的消费者所接受。近十年来，副溶血弧菌污染引起的食源性疾病暴发疫情已成为我省突出的公共卫生问题，严重危害人民的身体健康并造成经济财产的损失。

为进一步了解我省各类食品中副溶血性弧菌污染水平，以及对消费者的危害程度，于2009年－2010年，对散装熟肉制品、水产品等四大类11种2 215件食品进行副溶血性弧菌检测的同时，进行牡蛎、毛蚶等生食或半生食贝类海产品副溶血性弧菌感染风险评估。现将结果报道如下。

1 材料和方法

1．1 样品来源 样品采自杭州市、宁波市、温州市、舟山市等11个地级市和义乌市农贸市场、超市或养殖场，共计2 215件。

1．2 标准菌株和试剂 副溶血性弧菌标准菌株ATCC 17802、ATCC 33847由中国疾病预防控制中心营养和食品安全所赠送；Ta Ka Ra Taq（DR001）、100 bp DNA Ladder Mar ker购自宝生物工程（大连）有限公司；API 20E鉴定条购自法国梅里埃公司；科玛嘉弧菌显色培养基购自郑州博赛生物技术股份有限公司；碱性蛋白胨水（APW）、3．5%NaCl三糖铁琼脂（TSI）、3．5%Na Cl胰酪胨大豆琼脂（TSA）购自北京陆桥生物制品有限公司。所有培养基均经质量鉴定符合要求并在有效期内使用。

1．3 副溶血性弧菌分离、鉴定、计数方法 样品处理：牡蛎等贝壳类样品在自来水下刷洗外壳，用75%酒精棉球消毒外壳并拭干，无菌开壳，取出软组织和内容水作为检样。其它样品不经任何处理，直接作为检样。称取检样25 g，加入225 m L无菌碱性蛋白胨水，均质制成10－1稀释液，用碱性蛋白胨水依次制备成10－2、10－3、10－4、10－5稀释液。

定性检测：将上述10－1稀释液于36℃±1℃培养18 h。用接种环分别取上述培养后的碱性蛋白胨水增菌液分别划线接种科玛嘉弧菌显色琼脂平板。置37℃培养24 h。挑取可疑菌落，应用法国梅里埃API 20E细菌鉴定系统进行生化鉴定。

定量检测：用灭菌吸管吸取上述5种浓度稀释液1 m L，接种于含有9 m L 3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管内。每个稀释度接种3管，每管接种1 m L。置36℃±1℃温箱内，培养12 h。用接种环在每管挑取一环增菌液分别划线接种科玛嘉弧菌显色琼脂平板。然后按定性检测方法进行副溶血性弧菌分离鉴定。最后，根据副溶血性弧菌阳性试管数，查MPN表得出副溶血性弧菌的最终计数结果。

1．4 t dh、tr h毒力基因检测方法 （1）模板制备：挑取单个菌落于装有100μL dd H2O的Eppendorf管中，100℃裂解10 min，12 000 r／min离心5 min，取上清作为模板DNA 4℃ 保存备用。（2）引物与探针：针对t dh、tr h毒力基因设计引物序列（表1），由Ta Ka Ra公司合成。（3）tdh、tr h基因的检测：PCR反应总体系为20μL：5 U／μL Ta Ka Ra Taq 0．1μL、20μmol／L tdh基因和tr h 基因引物各0．1 μL，模板 DNA 2μL，10×PCR Buff er 2μL，25 mmol／L Mg Cl21．2μL，2．5 m M d NTP 1．6μL，用dd H2O补足至20μL。扩增条件：94℃预变性5 min。94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环。72℃延伸5 min，4℃下保存。产物经1．5%的琼脂糖凝胶电泳，用BIO－RAD凝胶成像仪观察并保存结果。t dh基因扩增条带大小为434 bp，tr h基因扩增条带大小为250 bp。

表1 tdh、tr h基因引物序列Tab．1 Primers for PCR amplification of tdh and tr h genes

1．5 副溶血性弧菌模拟烹饪灭菌效果试验 取副溶血性弧菌ATCC33847单菌落接种于150 m L 3%氯化钠碱性蛋白胨水增菌液，36℃±1℃增菌8 h后，分装至15 mm×15 mm玻璃试管，每管10 m L，共计30管。取25只管子放入较大的沸水浴中，0．5 min后取出5管立即放入5℃冷水中降温，以后每隔0．5 min取出5管，用同法降温。用平板计数法计数不同加温时间对副溶血性弧菌的灭菌率。以此模拟不同烹饪时间对副溶血性弧菌灭菌效果。

1．6 风险评估方法 副溶血性弧菌感染风险评估采用 Risk Ranger软件〔5－6〕。评估参数设置见表2。

表2 副溶血性弧菌风险评估参数设置情况表Tab．2 Parameter settings of V．par ahaemol yticus risk assessment

2 结 果

2．1 不同食品中副溶血性弧菌污染状况监测结果对4大类11种2 215件食品进行副溶血性弧菌定性检测结果，2 215件食品样品共检出副溶血性弧菌402株，总检出率为18．15%（402／2 215）。

在所有被检食品中，副溶血性弧菌的检出率以海水产品为最高，715件样品检出副溶血性弧菌269株，检出率达37．62%，占总检出数的66．92%。其中，鲜（活）海水产品副溶血性弧菌检出率更是高达43．06%，泥螺、牡蛎等生食海产品副溶血性弧菌检出率也达到了32．52%（120／369）。在生畜肉中的溶血性弧菌检出率为13．52%（38／281），在生禽肉中为11．44%（31／271）。另外，在散装熟肉制品、生食蔬菜、中式凉拌菜和鲜奶蛋糕中均检出副溶血性弧菌，检出率分别为3．44%（15／436）、2．10%（2／70）、2．98%（5／168）和2．08%（2／94）（表3）。

根据季节分布，4月～6月份副溶血性弧菌检出率为6．67%（17／225），8月～10月份副溶血性弧菌检出率为33．99%（69／203），8月～10月副溶血性弧菌检出率显著高于4月～6月（P＝0＜0．01，χ2＝46．445）。

从采样地点看，在农贸市场采集的食品副溶血性弧菌检出率为23．15%（69／298），超市采集的食品为13．47%（47／349）两者存在显著差异（P＝0．001＜0．01，χ2＝10．252）。其中水产品副溶血性弧菌检出率两地无显著性差异（P＝0．836＞0．05，χ2＝0．043），而生畜肉农贸市场样品检出率显著性高于超市样品（P＝0．018＜0．05，χ2＝5．636），生禽肉农贸市场样品检出率高于超市样品（P＝0．001＜0．01，χ2＝11．144）（表4）。

表3 不同食品中副溶血性弧菌污染状况Tab．3 Pollution status of V．par ahaemol yticus from foods

2．3 tdh、tr h毒力基因检测检测结果 随机选择82株副溶血性弧菌采用PCR方法检测，结果3株副溶血性弧菌tdh毒力基因阳性，所有菌株未检测到trh毒力基因。tdh毒力基因携带率为3．66%（3／82）。

2．4 副溶血性弧菌模拟烹饪灭菌效果试验结果分别采用0．5 min、1 min、1．5 min、2 min 4种煮沸时间对副溶血性弧菌进行模拟烹饪杀菌效果试验结果，浓度为4．5×106CFU／m L副溶血性弧菌经1．0 min煮沸后，浓度下降至3．0×103CFU／m L。2 min后，所有细菌均被杀灭，灭菌率100%。

2．5 贝类海产品副溶血性弧菌感染风险评估结果

根据2002年浙江省居民膳食营养摄入状况调查结果，按我省常住人口5 440万，流动人口2 000万、1%人口每年摄取牡蛎1次、副溶血性弧菌感染剂量106CFU／g、不经加热直接生食，根据副溶血性弧菌污染水平、毒力基因携带率监测结果，采用Risk Ranger分析软件分析，预期我省因生食或半生食牡蛎等贝类海产品每天副溶血性弧菌暴露人口为1．02×104人，每年因食用牡蛎等贝类海产品导致副溶血性弧菌食源性疾病的人数为4．42×104人，风险系数为50，牡蛎等生食或半生食贝类海产品属于高风险食品。

表4 不同采集地点副溶血性弧菌检出率（%）Tab．4 Detection rates of V．par ahaemolyticus from different sampling places（%）

图 1 M：100 bp DNA Ladder Mar ker；1：09－W－杭 州－2（112）；2：10－W－舟 山－372；3：10－W－衢 州－429；4：10－W－义乌－516；5：10－W－杭州－538；6：09－W－江 干－125 ；7：09－W－江 干－144；8：09－Y－玉 珠－11；9：10－W－临 海－161；10：09－Y－宁波－492；11：10－Y－江干－83；12：副溶血性弧菌 ATCC 17802；13：副溶血性弧菌 ATCC 33847；14：阴性对照Fig．1 Amplification of tdh and tr h genes by PCRM：100 bp DNA Ladder Mar ker；1：09－W－Hangzhou－2（112）；2：10－W－Zhoushan－372；3：10－WQuzhou－429；4：10－W－Yi wu－516；5：10－W－Hangzhou－538；6：09－W－Jianggan－125；7：09－W－Jianggan－144；8：09－Y－Yuzhu－11；9：10－W－Linhai－161；10：09－Y－Ningbo－492；11：10－Y－J－83；12：Vibrio par ahaemol yticus ATCC 17802；13：Vibrio par ahaemol yticus ATCC 33847；14：Negative Contr ol

在其它条件不变的情况下，如果通过短时加热，约50%的副溶血性弧菌被灭活，经Risk Ranger分析软件分析，预期我省因生食或半生食牡蛎等贝类海产品的风险系数为48，每天副溶血性弧菌暴露人口仍为1．02×104人，每年因食用牡蛎等贝类海产品导致副溶血性弧菌食源性疾病的人数为2．21×104人。

如果烹饪彻底，100%的副溶血性弧菌被杀灭。经Risk Ranger分析软件分析结果风险系数降至零。

3 讨 论

副溶血性弧菌是食源性疾病的主要致病菌之一。食品中污染副溶血性弧菌，在发达国家和发展中国家都是影响食品安全的主要因素。本研究结果显示，浙江省各类食品中副溶血性弧菌污染问题突出，在水产品、生畜肉、生禽肉、散装熟肉制品、生食蔬菜、中式凉拌菜和鲜奶蛋糕等食品中均有副溶血性弧菌检出。尤其是我省居民有生食半生食习惯的牡蛎等贝类海产品副溶血性弧菌检出率达到了32．52%，分离菌株副溶血性弧菌t dh毒力基因携带率为 3．66% （3／82）。结 果 与 潘 幸 福 报 道 基 本一致［1］。

从对不同采样地点监测结果来看，采自超市的生畜肉和生禽肉副溶血性弧菌检出率显著低于采自农贸市场样品，分析原因可能是超市管理制度较为完善，各类食品分区销售，污染几率低。由此结合副溶血性弧菌嗜盐的生长特性推测副溶血性弧菌传播途径首先海水产品本身携带了较高的副溶血性弧菌，通过市场流通环节，污染率进一步提高，同时污染至鲜冻淡水产品、生畜肉、生禽肉等附近区域销售的其它食品，最后通过食品加工人员生熟不分等原因污染至直接食用的生食蔬菜、中式凉拌菜和蔬菜色拉、熟制水产品、熟肉制品等即食食品，这也可从超市管理制度较为完善，各类食品分区销售，海水产品以外其它食品副溶血性弧菌污染率显著低于农贸市场这一现象得到进一步证实。

Risk Ranger为半定量风险评估软件，该评估软件通过回答11个问题，最终用从0到100之间的数字来表示风险的级别。其中，0代表没有风险，小于32为低风险，32～48之间为中度风险，大于48为高度风险。本次风险评估生食或半生食牡蛎等贝类海产品风险系数分别为50（生食）和48（半生食），如果烹饪彻底，风险系数降可至零。因此作者认为防止食品间交叉污染，不生食半生食海水产品，即食食品食用前加热处理应是减少副溶血性弧菌食源性疾病发生的最有效方法。

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