广西家畜布鲁氏菌病的监测分析＊

李 军，陈泽祥，杨 威，谢永平，李常挺，傅启宽，骆永泉，李常春，许力干，赵 武

家畜布鲁氏菌病（Br ucellosis）是由布鲁氏菌（Br ucell a）引起的一种人兽共患传染病，在全世界广泛分布，其主要症状表现为生殖器官和胎膜发炎、流产、不育及各种组织的局部病灶［1－2］。猪、牛、羊是布鲁氏菌的主要宿主，病菌通过流产胎儿、胎衣、羊水、子宫和阴道分泌物、精液、乳汁等排出体外，传染其它家畜和人类，给人类健康和畜牧业发展带来严重危害，世界动物卫生组织和我国农业部将其列为二类传染病。

广西在1952年开始有猪布鲁氏菌病的流行和传播，由于未采取有力防治措施，疫情扩散较快，至1961年疫情扩大到16个县（市）。1981年对广西布鲁氏菌病疫情普查显示，在当时行政划分的86个县（市）中，有畜间疫情的县（市）为53个，有人间疫情的县（市）为47个。1982年至1985年，畜间平均阳性率为4．98%，人间发病人数为463人［3－4］。

广西于1980年开展家畜布鲁氏菌病的防治工作，到2007年全自治区14个市的家畜布鲁氏菌病防治效果达到了国家农业部颁布的稳定控制标准并通过验收，所有家畜不再进行疫苗免疫［5］。

近几年来随着社会和经济的快速发展，广西牛、羊的饲养量日益增多，家畜的盲目引种和无序流动也日渐频繁，导致家畜布鲁氏菌病疫情随时有反弹的可能。为此，2009－2011年对广西14个市的家畜开展布鲁氏菌病的监测工作，以便及时掌握疫情动态，防止和控制布鲁氏菌病的发生和传播，保护人畜健康。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 主要试剂和仪器 布鲁氏菌虎红凝集抗原和凝集试管抗原购自中国兽药监察所；布鲁氏菌液体培养基购自美国BD公司、胰蛋白示购自英国Oxoid公司、马血清购自美国Ther mo公司；细菌基因组DNA提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司。PCR Taq Mix、DNA Mar ker 2购自广东东盛生物科技有限公司；细菌微量生化反应管购自杭州天和微生物试剂有限公司；其它试剂为国产分析纯试剂。PCR仪购自日本Ta Ka Ra公司；凝胶成像系统购自美国Alpha Innotech公司。

1．1．2 被检血清 2009－2011年对广西南宁、桂林、柳州、北海、钦州、防城港市、玉林、百色、河池、贺州、贵港、崇左、来宾和梧州14个市35个县（区）内的规模化养殖场、养殖小区和农村散养户按比例进行家畜血清抽检，着重对老疫区和新引进家畜的检测，共采集家畜血清16 143份，其中猪血清10 123份、牛血清4 767份、羊血清1 253份。

1．1．3 被检病料 采集自广西14个市的395份猪、588份牛、87份羊的脾、胎衣、流产胎儿以及布鲁氏菌试管凝集试验抗体阳性家畜的内脏、子宫或睾丸。采集病料装入密封袋后立即冷藏送检；不能即送的，置－20℃冷冻后送检。

1．2 方法

1．2．1 检测方法和判断标准 按照国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术GB／T18646－2002》进行。采用虎红平板凝集试验进行血清样本初筛，阳性或疑似阳性的血清样本再用试管凝集方法进行确认。对试管凝集方法确认的抗体阳性家畜进行扑杀，采集病料进行布鲁氏菌分离。

1．2．2 布鲁氏菌分离和鉴定 将采集的家畜胎衣、流产胎儿以及布鲁氏菌试管凝集试验抗体阳性家畜的内脏、子宫或睾丸用无菌生理盐水清洗后，在无菌条件下将流产胎儿的肝、脾、肾、淋巴结以及布鲁氏菌试管凝集试验抗体阳性家畜的内脏、子宫或睾丸、胎衣接种在含5%马血清的胰蛋白示琼脂培养基（胰蛋白示20 g，葡萄糖1 g，氯化钠5 g，马血清50 m L，琼脂20 g，水1 000 m L）中，置37℃、5%CO2培养箱中连续培养观察7 d。应用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养基上湿润、光滑、圆形、革兰氏染色为阴性小杆菌的细菌基因组DNA，按陈泽祥等建立的PCR检测方法对细菌进行布鲁氏菌的PCR鉴定［6］。按伯杰细菌鉴定手册（8版）进行布鲁氏菌的生化特性鉴定［7］。按钟旗等建立的方法进行布鲁氏菌种型的PCR鉴定［8］，将PCR产物送上海英骏生物技术有限公司测序。

1．2．3 布鲁氏菌毒力基因Vir B8的扩增和序列比较 应用钟旗等建立的方法对分离到的布鲁氏菌进行毒力基因Vir B8的PCR扩增［9］。利用DNA胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，回收纯化后与p MD－18T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，经双酶切和PCR鉴定后，将阳性重组质粒送上海英骏生物技术有限公司测序。将测序序列与Gen Bank中登录的各布鲁氏菌种型的Vir B8基因序列进行比较（表1）。

2 结 果

2．1 血清检测结果 应用虎红平板凝集和试管凝集方法对2009－2011年采集自广西14个市的10 123份猪血清、4 767份牛血清和1 253份羊血清进行布鲁氏菌病抗体检测。在2009年有1头种公猪，2010年有1头牛和8头山羊被检出为布鲁氏菌抗体阳性，抗体阳性家畜均来自农村散养户。具体检测结果见表2。

2．2 布鲁氏菌的分离和鉴定 对采集的395份猪、588份牛、87份羊的脾、胎衣、流产胎儿以及10份布鲁氏菌试管凝集试验抗体阳性家畜的内脏进行布鲁氏菌分离和鉴定。经布鲁氏菌PCR鉴定有1株从布鲁氏菌试管凝集试验抗体阳性羊分离的细菌被鉴定为布鲁氏菌（图1）。

表1 用于序列比较的菌株信息Tab．1 Bacterial strains infor mation for sequences comparison in this study

图1 布鲁氏菌PCR鉴定结果M．DNA分子质量标准2；1．羊种布鲁氏菌5号疫苗；2．1105菌株；3．阴性Fig．1 Brucella identification by PCR M：Mar ker 2；1：Br ucella melitensis vaccine No．5；2：Strain 1105；3：Negative control

表2 2009－2011年广西家畜布鲁氏菌病血清检测结果Tab．2 Serological test of livestock br ucellosis in Guangxi during 2009－2011

分离的布鲁氏菌生化特性结果显示，该菌能在流堇培养基（1∶5万）和碱性复红培养基（1∶5万）上生长；不产生H2S；不利用L－阿拉伯糖、D－核糖；利用葡萄糖、木糖、半乳糖和赤藓醇，其生化特性符合羊种布鲁氏菌（B．melitensis）的生化特性。

利用A MOS－PCR对分离的布鲁氏菌进行种型鉴定，PCR电泳结果显示在731 bp处出现扩增条带（图2）。将PCR产物送上海英骏生物技术有限公司测序，测序结果表明为羊种布鲁氏菌，将此菌命名为1105。

2．3 布鲁氏菌毒力基因Vir B8的扩增和序列比较

按钟旗等建立的方法对布鲁氏菌1105株提取的基因组DNA进行Vir B8基因的PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示获得720 bp的目的片段（图3）。

对目的片段进行回收、克隆和测序。将测序获得的核苷酸序列与参考序列进行比较，1105与羊种布鲁氏菌16 M强毒株和羊种布鲁氏菌5号疫苗（M5）株的同源性为100%；与其它种布鲁氏菌的同源性在99．7%～99．9%之间（图4）。羊种布鲁氏菌

图2 羊种布鲁氏菌PCR鉴定结果M．DNA分子质量标准2；1．阴性；2．羊种布鲁氏菌5号疫苗；3．1105菌株Fig．2 Brucella melitensis identification by PCR M：Mar ker 2；1：Negative control；2：Br ucell a melitensis vaccine No．5；3：Strain 1105

Vir B8核苷酸序列与其它种布鲁氏菌核苷酸序列的差异是在第576位核苷酸处有一个变异（C→T），但是这一变异属于同义突变，并未导致编码氨基酸的改变。

3 讨 论

广西14个市2009－2011年的家畜布鲁氏菌病监测结果表明近3年广西家畜布鲁氏菌病血清阳性率均在0．2%以下，仍然在稳定控制标准要求内。广西家畜布鲁氏菌病防治取得显著效果，主要是得到各级政府主管部门的重视和大力支持，将家畜布鲁氏菌病防治工作纳入工作范围，做到家畜布鲁氏菌病防治措施层层落实，从上至下都有专人抓管；防治经费也年年落实，使基层工作人员开展防治工作获得一定的经费补助，被扑杀病畜的畜主也得到一定的经济补偿。

2000年以前，因经济条件和养殖模式限制，广西家畜养殖以养猪为主，牛和羊的饲养量较少，家畜布鲁氏菌病主要是在猪流行，以猪种布鲁氏菌生物3型常见，牛和羊基本无疫情［3，10］。2000年以后，政府大力支持发展养殖业，广西的畜牧业得到快速发展，不少农户将牛、羊养殖作为致富手段，但是他们对《中华人民共和国动物防疫法》和《种畜禽管理条例》缺乏了解，没有申报就盲目私自从外省购买家畜，更未进行布鲁氏菌病的检疫。2002年牛种布鲁氏菌病疫情和2004年羊种布鲁氏菌病疫情就是通过无序引种的方式引入广西［11－12］。2010年检出的9例布鲁氏菌病抗体阳性家畜也是畜主未经畜牧行政主管部门许可，就私自从外省引回当地。在监测中，我们还发现农户引种渠道混乱，从多个地方引种并群的现象非常普遍，造成病源追溯的困难。因此，应加强对广大农户宣传家畜布鲁氏菌病防治知识，增强农户的风险防范意识。同时各县、市动物防疫机构应更加重视对动物引种的管理和动物流通环节的检疫，指导农户合法地从家畜布鲁氏菌病稳定控制地区进行引种。引种落地后对家畜进行1个月的隔离检疫，检测合格后方可解除隔离。

2009年检出的1例布鲁氏菌病抗体阳性猪来自家畜布鲁氏菌病老疫区，目前广西部分家畜布鲁氏菌病老疫区仍存在防疫条件差，疫源未能彻底清除的问题；同时一些乡镇或村级兽医防治人员对家畜布鲁氏菌病需要长期和艰苦的工作才能控制的形势认识不足，个别人员没有如实汇报种用家畜来源和养殖信息，或是没能及时完成采样检测任务等，防治工作存在应付和被动现象。因此，应定期在各县、市举办家畜布鲁氏菌病防治学习班，对基层兽医防治人员进行业务培训，提高他们的防治水平。

继续在广西14个市实施家畜布鲁氏菌病的监测工作，着重对老疫区的猪以及各县、市新引进牛、羊的检疫工作，准确掌握疫情信息。根据农村散养地区猪布鲁氏菌病的主要传播途径为患病公猪这一特点，在农村散养地区推广普及人工授精技术，提高配种范围和配种率，切断猪布鲁氏菌病的传播途径。

布鲁氏菌IV分泌系统是布鲁氏菌在细胞内繁殖和形成持续性感染所必需的一个毒力因子，它由Vir B1－Vir B12共12个蛋白组成［13］。Vir B8是布鲁氏菌IV型分泌系统的一个关键因子，属于早期分泌蛋白，在抵抗细胞吞噬和细胞内运输中起主要作用。研究证实Vir B8基因缺失的布鲁氏菌变异株毒力较亲本菌株弱，感染巨噬细胞的能力显著降低［14－16］。我们对分离的羊种布鲁氏菌 1105进行Vir B8基因克隆和测序，序列比较显示Vir B8基因在布鲁氏菌种型间高度保守。鉴于Vir B8基因与细菌的侵袭力密切相关且在布鲁氏菌种型间的高度保守，因此，对Vir B8基因的深入研究将为布鲁氏菌疫苗的研制、早期诊断试剂的开发提供线索。

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