羊种布鲁氏菌疫苗株PCR-RFLP鉴定方法的建立

马晓菁，钟 旗，叶 锋，谷文喜，刘丽娅，马俊杰，薛 晶，易新萍

（新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐 830000）

羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）是引起绵羊和山羊布鲁氏菌病（Brucellosis，以下简称布病）的重要病原，导致母羊不孕及流产，给养殖业带来巨大经济损失[1]，同时也可导致人感染，对人类公共安全造成巨大威胁。近年来的统计数据显示，羊种布鲁氏菌仍然是我国的主要流行菌株[2]。羊种布鲁氏菌共有3种生物型（生物型1、2和3），均能感染绵羊和山羊，但在不同地区，存在优势生物型差异。

疫苗免疫是防控布病的重要手段。在布病流行地区进行全群免疫是控制该病最适合的方式[3]。国际上普遍认为，羊种布鲁氏菌弱毒Rev.1活疫苗是预防绵羊和山羊布病的最佳疫苗。欧洲大部分国家以及亚洲的部分国家广泛使用该疫苗，用于绵羊及山羊的布病防控[4]。羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1是由Elberg等[5]1957年将Brucella melitensis强毒株6056通过两步筛选获得的，具有链霉素抗性。目前疫苗株Rev.1与羊种布鲁氏菌野菌株的鉴别主要依靠其生长特性，如Rev.1生长缓慢且菌落较小，具有链霉素抗性[6]。研究表明，疫苗株Rev.1的链霉素抗性与编码核糖体蛋白S12的rpsL基因突变密切相关[7-9]。Axel等[10]对疫苗株Rev.1的rpsL基因进行序列分析发现，91位脯氨酸突变为亮氨酸。

目的片段特定位点碱基突变常发生在某种限制性内切酶识别位点，造成酶切位点增加或消失，从而改变酶切性质。限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）就是利用这一特性，通过检测致病基因已知的点突变进行直接基因诊断，也可以此作为遗传标记进行连锁分析，从而进行间接基因诊断。本研究以编码核糖体蛋白S12的rpsL基因为研究对象，利用羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1的链霉素抗性且与rpsL基因突变相关这一特点，建立了一种快速、准确鉴定羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1的 PCR-RFLP方法，为今后区分疫苗株Rev.1免疫与羊种布鲁氏菌自然感染提供了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 羊种布鲁氏菌减毒活疫苗株Rev.1、羊种布鲁氏菌标准株16M：均购自中国兽医药品监察所；牛种布鲁氏菌疫苗株A19、pUC-19K、大肠杆菌E.coliDH5α克隆菌株：均由新疆畜牧科学院兽医研究所保存。

1.1.2 主要试剂 Brucella broth培养基和Brucella agar培养基：购自美国BD公司；PCR mix：购自北京庄盟生物技术有限公司；NciI限制性内切酶：购自NEB公司；质粒提取和胶回收试剂盒：购自Promega公司。

1.1.3 引物 根据Genbank已公开发表羊种布鲁氏菌株16M序列（AE008917），应用Primer 5.0软件设计rpsL基因相应的引物序列。上游引物RpslF：CATGAAGCGTCAGCTTCCTCT；下游引物RpslR：CTTGCCATGAAGCATGACTGGCA。扩增片段为681 bp。委托上海基康生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 布鲁氏菌AMOS-PCR鉴定 以羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1、羊种布鲁氏菌标准株16M、牛种布鲁氏菌疫苗株A19基因组DNA为模板，按照参考文献[11]中的AMOS-PCR方法，组合插入序列IS711、牛种布鲁氏菌（1.2.3a型）、牛种布鲁氏菌（5.6.9.3b型）以及羊种布鲁氏菌（1.2.3型）。反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 60 s，60 ℃ 90 s，72 ℃ 60 s，40 个循环，72 ℃ 10 min。

1.2.2 羊种布鲁氏菌rpsL基因扩增 以羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1和羊种布鲁氏菌标准株16M基因组DNA为模板，以RpslF和RpslR为引物，PCR扩增rpsL基因。反应程序为：95 ℃预变性 10 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，72 ℃ 10 min，共30个循环。PCR产物切胶回收与pMD19-T载体混匀后，置4 ℃连接过夜、转化、铺板，37 ℃恒温培养。挑取阳性单克隆菌落于含Amp+（50 mg/mL）LB液体培养基中，提取质粒送上海生工测序。

1.2.3rpsL基因PCR产物NciI酶切 分别将羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1和羊种布鲁氏菌标准株16M 的rpsL基因PCR扩增产物 37 ℃ 2 h酶切，其中 NciI酶 0.5 µL、10×NEBuffer 1 µL、PCR 扩增产物6 µL，灭菌水补足至10 µL。

2 结果

2.1 布鲁氏菌AMOS-PCR鉴定

对羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1、羊种布鲁氏菌标准株16M、牛种布鲁氏菌疫苗株A19进行AMOS-PCR鉴定，发现牛种布鲁氏菌A19扩增出498 bp条带，羊种布鲁氏菌Rev.1和16M均扩增出731 bp条带（图1）。

2.2 rpsL基因扩增

羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1和羊种布鲁氏菌标准株16M分别扩增rpsL基因，均获得681 bp条带（图2），与目的片段大小一致。测序结果与Genbank发表rpsL基因序列一致。

2.2 PCR产物NciI酶切

分别将羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1和羊种布鲁

图1 布鲁氏菌AMOS-PCR扩增结果

图2 rpsL基因PCR扩增结果

氏菌标准株16MrpL基因的PCR产物NciI酶切，电泳后可见标准株16M出现384 bp条带，疫苗株Rev.1出现500 bp左右条带（图3）。

3 讨论

羊种布鲁氏菌的自然宿主是成年山羊和某些品种绵羊，能够引起绵羊和山羊布病的发生和流行。牛种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌也会造成绵羊和山羊感染，但几乎未见临床病例[12]。近年来有报道显示，牛乳中能分离到羊种布鲁氏菌[13]，因此羊种布鲁氏菌不仅对畜牧业发展造成威胁，同时影响人类健康。在布病防控和根除过程中，疫苗免疫具有重要意义。在我国，对羊免疫常选用弱毒活疫苗猪种布鲁氏菌S2

[14-15]。但国际上公认，羊种布鲁氏菌Rev.1是用于羊布病防控最有效的疫苗，在希腊、约旦、塔吉克斯坦、蒙古和西班牙等国家具有显著的布病防控效果[16]，但免疫后的鉴别诊断成为亟待解决的问题。

图3 rpsL基因PCR扩增产物NciI酶切

羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1为羊种1型布鲁氏菌，与近年来我国主要流行的羊种3型布鲁氏菌存在型的差异。目前AMOS-PCR方法能够快速将羊种布鲁氏菌与其它种型布鲁氏菌区分，但羊种布鲁氏菌型的鉴定依靠染料抑制、单项特异性血清凝集，以及噬菌体试验结果判定，不仅耗时，而且增大了操作人员感染风险。

生物型的判定也无法最终区分疫苗株与野株。RFLP分析是以DNA指纹图谱为基础用于微生物分型鉴定的方法。Jensen[17]等利用该方法证实RB51菌株与其它牛种布鲁氏菌株不同。Ridler[18]等用限制性内切酶SwaI消化绵羊附睾种布鲁氏菌进行电泳后发现绵羊附睾种存在变种。在我国，骆利敏等[19]研究发现，猪种与犬种菌之间关系密切。

4 结论

本研究利用疫苗株Rev.1 编码核糖体蛋白S12的rpsL基因片段CCG突变为CTG，导致酶切位点NciI缺失，建立了羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1的PCR-RFLP鉴定方法，可以快速、特异地区分羊种布鲁氏菌疫苗株与野株。

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