荧光双染和三维重建技术对蠕形螨的形态观察和功能探讨＊

佘俊萍，张锡林，王光西，孙 源，王利芳，胡朝惠

蠕形螨寄生于人和哺乳动物的毛囊和皮脂腺内，已知有140余种和亚种，寄生于人体的主要有毛囊蠕形螨（Demodex f olliculorum）和皮脂腺蠕形螨（Demodex brevis）两种，感染以毛囊蠕形螨为主［1］。国内人群感染率在0．8%～81%［2］，以颜面、鼻唇沟［3］，额，眼睑和胸背等部位多见，临床常导致皮肤瘙痒、丘疹、脂溢性皮炎、痤疮、酒渣鼻等。毛囊蠕形螨个体微小（100～400μm），比重轻、透明且脆弱，体表附厚重皮脂，这些因素成为研究其形态、结构及其生物学功能等特性的瓶颈。徐荫祺［4］、丁晓昆［5］曾用普通扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）对人体蠕形螨进行观察，近年，赵岩等［6］、刘莹等［7］、冯新玉等［8］也通过扫描电镜对人体蠕形螨超微形态进行了补充研究，但均对一些具分类、功能意义的结构观察还不够，影响了虫种鉴别及致病机制的研究。

激光扫描共聚显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）的工作原理是在荧光显微镜成象的基础上，利用共聚焦光路和激光扫描获得样品的显微图像，经过计算机进行图象处理，获得细胞或组织内部结构的荧光图像。激光扫描共聚焦显微镜具有高灵敏度和能观察空间结构的独特优点，从而对被检样品从停留在表面、单层、静态局面的观察进展到立体、断层扫描、动态全面的观察，并已在生命科学研究中得迅速的应用，为该领域新一代强有力的研究工具。本实验采用CLSM对人体毛囊蠕形螨进行三维形态学观察，尝试观测虫体的进一步形态和结构。

1 材料和方法

1．1 取材方法 在泸州医院附院皮肤科采集患者鼻部皮脂，采用自制刮取式取螨器、挑螨针作为取螨工具，以早先建立的方法［9］，选用2% （安利）餐具洗洁精作为皮脂、脂肪溶解剂，用凹玻片作为清洗容器，从受检者皮脂分泌物中快速分出清洁的活毛囊螨置于1．5 mL离心管中，50支／管，75%酒精固定，－4℃保存备用。

1．2 实验 激光共聚焦显微镜为Leica TCS SPE，5810R／5804R冷冻离心机为 Gene Company Li mited，碘化丙啶（propidiu m iodide，PI）购自Sigma公司，异硫氰酸 （fluorescein isothiocyanate，FITC），购自美国Bio Legend公司，2．5%戊二醛等其他试剂购自上海生物工程技术服务有限公司。

1．3 实验方法 将盛有毛囊螨的离心管离心30 s，1 000 r／min弃上清，吸取管底的毛囊蠕形螨均匀涂在用多聚赖氨酸处理过的玻片中央进行固定，待酒精挥发后，滴加用PBS稀释10倍的FITC进行初染，37℃，恒温培养箱孵育2 h，用0．01 mol／L的PBS洗涤2次，5 min／次，再滴加5μg／ml PI室温避光15 min复染，用0．01 mol／L的PBS洗涤4次，5 min／次。稍晾干后，滴加80%甘油封片盖上盖玻片，用激光共聚焦显微镜进行观察，选取虫体不同部位、不同角度、不同层面进行连续光学切片，并使用Imaris 5．0软件进行三维重建。

2 结 果

2．1 激光扫描共聚焦显微镜连续光学切片激光扫描共聚焦显微镜以每0．2μm厚度对完整虫体进行从上到下连续光学切片，获得到45张图片（图1）。

图1 激光扫描共聚焦显微镜下虫体连续光学切片Fig．1 Serial optical sections of DF by CLSM

实验发现，虫体与FITC和PI均有很强的结合力。在激发光下，荧光信号将虫体形态清晰的展现出来。虫体蛋白与FITC结合在激发光束的作用下发出绿色荧光，虫体细胞核与PI结合后在在激发光束的作用下发出红色荧光。清晰可见毛囊蠕形螨的细微结构，比单纯使用PI或FITC染色效果更佳。选取虫体不同部位、角度、不同层面进行断层扫描，并使用Imaris5－0－1w软件进行了三维图象的构建。2．2 主要三维形态特征 虫体呈蠕虫状，半透明，左右对称，腹面扁平，背面隆起，长约0．25 m，宽约0．05 mm（图2），厚约0．02 mm（图5、6），分颚体、足体和末体三部分（图2）。颚体扁平，呈对称五边形，（图3、4、5），前端略窄（图5），位于躯体最前端，伸出的一对突出物，是虫体的基内叶（basendite），颚体背面前端有一对呈双叶形短铆状的背基刺（supraeoxals spine），以柄着生于基部的陷窝内，推测为一种感觉器官，它对蠕形螨的种类鉴别上有一定意义。第一对足体中部见马蹄形咽泡（pharyngeal bul b），为分类的特征型结构（图4）。颚体背面的中部有一针状的锥状突（图5），向前伸出，其前端被颚体腹面的口下板延伸的膜状结构所包绕，形成短喙状。颚体背面中部见一对对称红染的结构为“眼点”（eyespot），推测为感觉乳突，主要感受温度和光的刺激（图3）。自足体起，至第3对足虫体厚度开始逐渐达到至最厚（图5），足4对，粗短呈芽突状，足基节与躯体愈合成基节板，单个足呈圆锥形，套筒状，结构相似，每足分4节，粗壮（图3、4）。阴门在第四对足基节片之间的后方，为一圆形开口（图2、4、6）。毛囊螨末体细长如指状，约占虫体全长的3／4，尾部钝圆，体表覆有明显环形横纹，似“同心圆”样，突出体表，未见排泄孔道图（图2）。

特别是此次见到毛囊螨的上消化道，染色后呈红色，从鄂体最前端中央出现一根管道状结构，到鄂体中部开始分为左右两支，并延伸到第一对足中部，呈现倒置“Y”字形，推测为染料从毛囊螨“口前腔”浸入消化道所至（图3）。

图2 毛囊蠕形螨全虫形态Fig．2 Three－di mensional reconstr uction of DF

3 讨 论

激光扫描共聚焦显微镜是目前生物医学领域中最先进的荧光成像和细胞分析工具之一。可对标本各深度层面的信息进行三维重建，从而得到表面及内部结构都非常清晰的三维图像。异硫氰酸（fl uorescein isot hiocyanate，FITC）是目前应用最广泛的荧光素，其有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。碘化丙啶（pr opidine iodide，PI）是一种标记细胞核的核酸染料，它是一种灵敏的细胞化学荧光探针，能够透过细胞膜而使细胞核红染［10］。将毛囊螨用FITC初染，再用PI复染后置于激光共聚焦显微镜下观察：虫体与两种荧光染料结合充分，虫体蛋白与FITC结合后在激发光束作用下发出绿色荧光，虫体细胞核与PI结合后发出红色荧光。将所获连续光学切片用Imaris5－0－1 w软件进行三维重建，可在三维空间中随意拖动虫体各角度观测其结构。

本研究旨在通过三维形态的研究探讨虫体各结构的功能。虫体图像十分清晰，色彩鲜明，特别是“咽泡”“眼点”“基节片”、“足”和“阴门”等结构。研究发现，颚体呈“对称五边形”（图3），与以往描述的呈“不规则四边形”或“梯形”略有不同，颚体基部尖细，此特点利于的摆动。同时可见虫体颚体背面中间有左右对称排列的一对类似“眼睛”的结构，突出于虫体体表，以往资料极少有提及也未详细描述过，推测该结构为虫体的一种感觉器官，主要感受温度和光的刺激，也可能是原生动物和低等无脊椎动物的小形而构造简单的视觉器官，且称“眼点”（eyespot）或感觉乳突。Desch（1970）［12］曾通过光镜和电镜研究发现：毛囊螨口前腔底部后方有一短小食管，并从口前腔底部开始弯曲向下通至杯形的“咽泵”，食管腔形状可随进食时压力变化而发生改变，直径仅一个微米，认为蠕形螨进食的是液体食物。由此，推测见到的倒置的“Y”字形的结构应该为摄食通道，应为“口前腔”经“食管”到“咽泵”部分。本实验中清晰见到阴门呈“近圆形”，与李朝品（2006）［11］指出阴门为一“狭长纵裂状开口”略有不同，我们也曾经观察到阴门呈“狭长纵裂状开口”和“近圆形”的情况，这可能是雌性生殖器的个体形态差异或是其在繁殖期及交配期形态发生改变。

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