胸腔镜与蛋白指纹图谱技术在胸腔积液诊断中的应用

陈力舟 王岗玲 王鸿翔 杨国育 李天林 刘坦业

胸腔积液在临床上较为常见，其诊断与鉴别诊断一直是临床医生十分关注的问题。目前常用的胸膜活检、胸腔积液细胞学及生化检查等实验室诊断指标存在灵敏度、特异度上的局限，并不能达到早期诊断、早期治疗的目的，并且阳性率低，有创伤，不易被患者接受。

蛋白质指纹图谱技术（proteomic fingerprinting technology，PFT）是近年来发展起来的一种蛋白质组学研究技术，现已广泛应用于生物大分子研究，是蛋白质组学研究中不可或缺的分析工具。它在一定条件下，能够将样品分子电离成离子，然后测定这些离子的质荷比（mass－to－charge，m/z）和强度，并绘制出蛋白指纹图谱，进一步对其进行定性和定量分析。目前国内外应用PFT于恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等疾病的诊断均获得很好的结果。但应用蛋白质组学技术用于胸腔积液诊断尚鲜见报道。为此，笔者进行了胸腔积液血清蛋白指纹图谱联合胸腔镜检查的初步研究。

资料和方法

一、临床资料

2009年1月至2010年12月本院住院经影像学检查发现有胸腔积液，经内科胸腔镜检查、病理学（或细菌学）、胸腔积液蛋白指纹图谱检测临床确诊的121例住院患者，选择具备观察条件，无其他并存病者80例，平均年龄51.5（32～74）岁。根据上述诊断，将80例患者分为两组：恶性胸腔积液组30例（Ⅰ组），其中男21例，女9例，平均年龄59.7（40～81）岁；结核性胸腔积液组50例（Ⅱ组），男26例，女24例，平均年龄35.8（20～64）岁。病程8 d至3个月不等。两组主要症状为咳嗽、气促、胸痛、发热。

30例恶性胸腔积液患者中胸膜间皮瘤7例（23.3%），胸膜转移瘤23例（76.7%），23例病理分型：鳞癌4例，腺癌12例，肺泡细胞癌2例，小细胞肺癌2例。乳腺癌、细支气管癌、肾转移癌各1例。

二、方法

B超定位下行胸腔镜检查，观察胸膜改变，取样进行病理活检，同时抽取胸腔积液作蛋白质指纹图谱检测。

（一）内科胸腔镜检查

设备及实施：日本Olympus LTF－240型胸腔镜，与Olympus电视监视系统连接。术前进行出凝血时间、血气分析、血压、心电图等检查，并接上心电监护仪，监测血压、脉搏、血氧饱和度。患者取健侧卧位（病灶位置特殊时取相应的体位），保持自主呼吸良好，查体再次确认穿刺点。常规消毒、铺巾，用2%利多卡因5 ml局部注射逐层浸润麻醉达胸膜。用手术刀切开皮肤1.5～2 cm，逐层钝性分离胸壁组织达胸腔，将套管针（Trocar）插入，有突破感后拔出针芯，将内科胸腔镜沿Trocar送入胸腔。尽可能抽净胸腔积液，尽量松解粘连带，顺序观察肋胸膜、膈胸膜、纵隔胸膜、脏层胸膜、肺表面及肺叶膨胀状况、膈肌活动度及心包，再观察壁层等，对可疑病变部位直视下多处活检4～8块。操作结束后经Trocar放置7 mm外径的硅胶胸腔引流管，引流管接水封瓶行闭式引流。所取胸腔积液送细胞学并蛋白指纹图谱检查。

（二）胸腔积液蛋白指纹图谱检测

1.主要仪器及样品准备：选用美国Ciphergen公司产品Ciphergen Protein Chip System（CPCS，型号为PBS II/C型）蛋白指纹图谱仪。蛋白磁珠（WCX Magnetic Beads）为美国Ciphergen公司生产。样品准备：抽取各组患者胸腔积液2 ml，置于4℃冰箱中保存1～2 h，然后4℃20 000×g离心10 min，取上层胸腔积液分装后，置－80℃冰箱内保存。

2.步骤：（1）胸腔积液样品处理：取5μl胸腔积液样品加10μl裂解液（湖州赛尔迪生物医药科技有限公司提供）混合孵育（室温，下同）30 min后，加入185μl缓冲液（磷酸盐缓冲液，p H＝7.4）稀释。（2）取蛋白磁珠50μl加入200μl PCR管中，磁铁上孵育1 min，去除上清液；PCR管加入50μl缓冲液洗脱5 min后，磁铁上孵育1 min，去除上清液；PCR管再次加入100μl缓冲液洗脱5 min，PCR管磁铁上孵育1 min，PCR管加入100μl处理好的胸腔积液样品。（3）加入胸腔积液样品的PCR管置于室温孵育30 min，PCR管磁铁上孵育1 min，去除上清液，PCR管加入100μl缓冲液洗脱5 min，PCR管磁铁上孵育1 min，去除上清液，PCR管加入10μl洗涤缓冲液洗脱5 min，PCR管磁铁上孵育1 min，取5μl上清液移至另一PCR管中，PCR管加入5μl人葡萄球菌蛋白A（SPA）饱和溶液充分混匀，取1μl混合溶液加样到全钢（Au/Steel）芯片上风干。

3.数据收集：待芯片干燥后，放入Protein Chip Biomarker SystemⅡ质谱仪进行数据收集。用Ciphergen protein chip 3.0软件自动采集数据。

4.统计学分析：应用Biomarker Pattern 5.0软件对芯片检测得到的蛋白质相对含量及蛋白质质荷比数据进行处理，所有测得的蛋白质图谱由上述软件进行统一标准化。对所获的数据应用SPSS 10.0软件进行统计学分析，计算“±s”和概率（P 值），以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。采用SPSS 13.0软件进行χ2检验和灵敏度、特异度评价。

结 果

一、胸腔镜并病理检查

胸腔镜下主要表现：（1）结核性胸膜炎：壁层及膈胸膜弥漫性充血、增厚的基础上，可见胸膜纤维条索粘连带、膜脏层、壁层均匀分布弥漫性灰白色粟粒样小结节样或干酪样坏死（图1，2）。（2）恶性胸腔积液患者：可见大小不等结节或息肉样、瘤样团块，有的呈葡萄串样、菜花样，表面坏死，纤维条索粘连或胸膜表面凹凸不平（图3，4）。

图1 男，32岁。左胸膜肉芽肿性炎症伴干酪样坏死，符合结核病变 图2 男，44岁。胸膜检查见大量肉芽肿性炎症伴干酪样坏死，符合结核病变 图3 男，43岁，肺癌。胸膜检查见少量符合恶性瘤细胞，免疫组化证实为转移性肺腺癌 图4 女，42岁。胸腔镜下见大量粘连光带，壁层胸膜见一小结节，病理证实为腺癌

二、蛋白指纹图谱检测结果

对80例患者行蛋白指纹图谱检测，在相对分子质量0～50 000范围内对所绘制的蛋白峰进行分析比较：两组患者标本检测结果共获得364个蛋白峰，其中 7 个 峰 5335、8048、11 700、11 670、15 982、11 683、7700 m/z在Ⅰ组与Ⅱ组之间表达有差异（表1），以5335、8048、11 700和11 670 m/z为高表达，以11 683、7700、15 982 m/z为低表达。两组代表性蛋白峰见图5～8。

表1 Ⅰ组和Ⅱ组之间差异有统计学意义的7种蛋白峰

三、鉴别诊断模型的建立

根据Ⅰ组、Ⅱ组胸腔积液患者蛋白质指纹图谱数据的比较，应用任何一个单一的蛋白峰值无法完全鉴别Ⅰ组和Ⅱ组差异。笔者应用Biomarker Pattern 5.0软件对芯片监测的蛋白质相对含量及蛋白质质荷比数据进行处理，综合分析结果显示，可以采用下列3种方式建立诊断模型：

选择11 670、11 700、5335、8048 m/z建立Ⅰ组与Ⅱ组的鉴别诊断结果：Ⅰ组阳性率93.3%（28/30），Ⅱ组阳性率76.0%（38/50），两组差异有统计学意义（χ2＝3.90，0.01＜P＜0.05）（表2）。

图8 8048 m/zⅠ组、Ⅱ组胸腔积液蛋白峰

表2 应用11 670、11 700、5335、8048 m/z 4种蛋白峰组合对Ⅰ组与Ⅱ组进行鉴别诊断的结果

依据蛋白峰值表达情况选择11 670、11 700 m/z 2种蛋白峰建立Ⅰ组与Ⅱ组的鉴别诊断模型结果，诊断Ⅰ组阳性率达83.3%（25/30），Ⅱ组为24.0%（12/50），两组差异有显著统计学意义（χ2＝26.55，P＜0.01）倾向于判定恶性胸腔积液，两组蛋白峰值检测结果进行对照，其诊断恶性胸腔积液敏感度为83.3%（25/30），特异度为76.0%（38/50）（表3）。

表3 应用11 670、11 700 m/z 2种蛋白峰组合对Ⅰ组与Ⅱ组进行鉴别诊断的结果

依据蛋白峰值表达情况选择5335、8048 m/z 2种蛋白峰建立Ⅰ组与Ⅱ组的鉴别诊断模型结果，诊断Ⅰ组阳性率达16.7%（5/30），Ⅱ组为52.0%（26/50），差异有显著统计学意义（χ2＝9.86，P＜0.01），倾向于判定结核性胸腔积液（以2组蛋白峰值结果对照更为确切），2组蛋白峰值检测结果进行对照，其敏感度为52.0%（26/50），特异度为83.3%（25/30），见表4。

讨 论

胸腔积液病因复杂，不同病因的胸腔积液其治疗措施和预后截然不同。恶性胸腔积液的定性诊断与其临床分期和制订治疗方案至关重要，而早期诊断和规范治疗又是改善预后的关键。然而常用的经皮胸膜活检、胸腔积液细胞学检查阳性率低，检出率仅有60%［1］，敏感度和特异度都不尽如人意，甚至出现不良反应，致使胸腔积液的鉴别非常困难。为此，探索和建立一种简单、快速、敏感度高和特异度高的胸腔积液早期诊断技术已成为当前亟待解决的问题。

表4 应用5335、8048 m/z 2种蛋白峰组合对Ⅰ组与Ⅱ组进行鉴别诊断的结果

内科胸腔镜检查是胸膜疾病的重要诊疗手段，主要应用于经无创方法不能确诊的胸腔积液患者的诊治。其影像检查部位和胸腔镜实际操作部位一体化设计、创伤小、视野广阔，较硬质胸腔镜操作灵活，对胸腔积液等胸膜疾病的诊断和治疗具有重要的临床应用价值。只需在患者的胸壁切开约1.2～1.5 cm的皮肤切口，利用胸腔镜在直视下观察胸腔的变化并可对胸膜（脏、壁层）的病灶进行直接活检，阳性率高，痛苦较小，风险低，并发症少，通过内科胸腔镜对各种良恶性胸腔积液确诊率在95%～100%之间，是一项相当实用的诊疗技术［2－3］。

PFT是一种崭新的研究蛋白质全貌的高通量技术平台，在肺结核与肺部恶性肿瘤的诊断方面有一定的价值，能检测到与其相关的特异性蛋白标志物，并构建出敏感度、特异度均较高的诊断模型。且能对临床常见的体液标本（血清、尿液、脑脊液、胸腹腔积液等）进行检测分析，具有快速、简便、准确和超敏感等特点。由于胸腔积液中蛋白质含量较高，应用PFT方法分析比较良恶性胸腔积液的蛋白表达差异乃至发现胸腔积液特异表达的蛋白质，对于探索发现相关肿瘤标志物具有重要意义［4－7］。

对30例恶性胸腔积液和50例结核性胸腔积液应用PFT测定结果，血清标本中共获得364个蛋白峰，其中7个峰在两组中表达有差异性，但以11 670、11 700、5335、8048 m/z 4种蛋白峰组合进行Ⅰ组与Ⅱ组的鉴别诊断结果，Ⅰ组阳性率93.3%（28/30），Ⅱ组阳性率76.0%（38/50），两组比较差异有统计学意义（χ2＝3.90，0.01＜P＜0.05）；应用11 670、11 700 m/z 2种蛋白峰组合模式进行Ⅰ组与Ⅱ组的鉴别诊断模型结果，倾向于判定恶性胸腔积液，两组蛋白峰值检测结果进行对照，其诊断恶性胸腔积液敏感度为83.3%（25/30），特异度为76.0%（38/50）；5335、8048 m/z 2种蛋白峰组合模式进行Ⅰ组与Ⅱ组的鉴别诊断模型结果，两组比较差异有显著统计学意义（χ2＝9.86，P＜0.01），倾向于判定结核性积液，其敏感度为52.0%（26/50），特异度为83.3%（25/30）。

近年PFT技术在临床肿瘤研究中的应用得到很好的结果。该技术通过对样本中整个蛋白质全貌进行检测并绘制蛋白质指纹图谱，与相应良性疾病患者指纹图谱比较，就能找到多种差异蛋白质并优化组合成多标志物诊断模型，多个标志物的组合能同时提高诊断的敏感度和特异度。因此目前该技术在肺癌等多种肿瘤的早期诊断、转移和复发监测中显示出强大优势［8］，Poon等［9］研究表明，与慢性肝病患者相比，肝癌患者血清质荷比为8811 m/z的蛋白质减少，而8944 m/z的蛋白质却增加，这2个蛋白组合能发现慢性肝病中的肝癌患者，其检测敏感度为92%、特异度为90%。为此，笔者对PFT技术应用于恶性、结核性胸腔积液的鉴别诊断进行研究并获得以上结果。

胸腔积液蛋白指纹图谱检测技术在结核性与恶性胸腔积液的诊断方面有一定的价值。该方法简便、标本用量少，能快速、有效地检测到与其相关的特异性蛋白标志物，并构建出敏感度、特异度均较高的诊断模型［8，10］，对胸腔积液病因早期诊断、早期治疗等方面具有一定的价值，为临床上胸腔积液病因诊断提供了良好的前景，为恶性或结核性胸腔积液患者提供了一种新的无创诊断和鉴别诊断方法。但在判读方面还应该进一步研究，以便提高对这两种病的敏感度与特异度。

综合分析内科胸腔镜检查并活检病理与胸腔积液蛋白指纹图谱检测两者在结核性与恶性胸腔积液的诊断方面均有优势，但笔者认为胸腔镜检查并病理活检还是优于胸腔积液蛋白指纹图谱检测。虽然前者有一定的微创性，但目前还是认为病理检查优于其他检查方法。胸腔积液蛋白指纹图谱检测技术简便、快速，是鉴别结核性与恶性胸腔积液特异性标志物的有效手段，但目前还不能依据单一蛋白峰值来判定，尚需应用蛋白峰组合模式建立鉴别诊断模型。这正是在判读方法上尚需进一步深入研究之处。

［1］Porcel JM，Vives M，Esquerda A，et al.Use of a panel of tumor markers（carcinaembryonic antigen，cancer antigen 125，carbohydrate antigen 15－3，and cytokeratin 19 fragments）in pleural fluid for the differential diagnosis of benign and malignant efusions.Chest，2004，126（6）：1757－1763.

［2］童朝辉，王臻.内科胸腔镜的临床应用.中国实用内科杂志，2008，28（2）：104－106.

［3］何权瀛，吕喜英.恶性胸腔积液的病因诊断及对诊断手段的评价.中国实用内科杂志，1999，19（5）：297－298.

［4］许洋.蛋白指纹图谱技术在实验诊断与临床医学中的研究进展.基础医学与临床，2007，27（2）：134－142.

［5］吴雪琼，张俊仙，梁艳，等.应用蛋白质谱建立活动性肺结核病的血清诊断模型.中华微生物学和免疫学杂志，2008，28（11）：1040－1043.

［6］王琳，翁丽珍，李学玲，等.蛋白质指纹图谱技术在肺结核、肺癌鉴别诊断中的应用研究.中国防痨杂志，2011，33（4）：209－213.

［7］翁丽珍，王琳，李学玲，等.肺结核蛋白指纹图谱诊断技术研究.中国人兽共患病学报，2010，26（11）：1048－1051.

［8］胡朝军，李永哲.蛋白质指纹图谱技术在疾病研究中的应用.临床检验杂志，2008，26（3）：227－229.

［9］Poon TC，Yip TT，Chan AT，et al.Comprehensive proteomic profiling identifies serum proteomic signatures for detection of hepatocellular carcinoma and its subtypes.Clin Chem，2003，49（5）：752－760.

［10］周继红，柳广南，黄斯明，等.表面增强激光解析电离飞行时间质谱法筛选肺癌患者血清和肺泡灌洗液中标志蛋白的研究.中华结核和呼吸杂志，2011，34（4）：274－277.