小鼠子宫内膜细胞的原代培养与鉴定＊

乔明霞 刘 萍 徐 艳 李允广

山东省枣庄市妇幼保健院 277102

随着辅助生殖技术的发展，IVF－ET已经是治疗不孕不育的重要手段，但是临床的妊娠率仍然不高。一部分原因是由于在胚胎种植窗期，子宫内膜由非接受态转化为接受态的过程出现了异常。人们对该过程的确切调控机制知之甚少，而直接在体研究有很大的局限性，因此子宫内膜体外培养体系的建立非常重要，对研究子宫的生殖生理具有重要意义。但是小鼠子宫较小，内膜组织取材困难，纯度不高，导致进一步的培养发生困难，探讨一种操作步骤简单、细胞损失少、纯度高的新的细胞培养技术非常必要。本文介绍一种相对简捷的子宫内膜腺上皮细胞及基质细胞原代培养方法。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级昆明种成年雌性小白鼠（烟台市绿叶制药有限公司动物中心提供）20只，8～10周龄，体重25～30g。雌雄按2∶1比例合笼，次晨检查阴栓，发现阴栓者记做妊娠第1天。

1.2 设备和试剂 （1）主要设备：二氧化碳培养箱（Thermo Forma3131）、Olympus倒置显微镜（日本）、200目筛网、离心机（Eppendorf5702）、超净工作台（青岛Haier集团公司）。（2）试剂：DMEM／F12高糖培养液（Hyclone公司）、胎牛血清（FCS，Gibco公司）、胶原酶Ⅰ（Gibco公司）、双抗（Hyclone公司）、兔抗鼠角蛋白抗体、兔抗鼠波形蛋白抗体、链霉素生物素－过氧化物酶（SP）标记的羊抗兔免疫组化试剂盒（均为北京中山金桥生物公司）。

1.3 方法

1.3.1 妊娠第4天雌鼠断颈处死，迅速无菌取出子宫，置于含双抗的DMEM／F12（4℃预冷）的3.5cm培养皿中，去除脂肪后，再次用含双抗的DMEM／F12培养液冲洗子宫两遍，取弯折成90°的20ml注射器针头用挤压法挤出小鼠子宫内膜组织。将子宫内膜剪成细颗粒状组织块。用2g／ml的胶原酶Ⅰ按3∶1混合，37℃培养箱消化150min。以含血清的DMEM／F12培养液终止消化，反复吹打后收集培养液，200目滤网过滤将组织弃去。1 000r／min离心10min收集内膜细胞沉淀。吸去上清液，加少许含10%FCS的培养液轻轻吹打细胞制成细胞悬液。调整细胞密度，以1×105／ml的密度接种于6孔培养板（培养板孔内放有多聚赖氨酸包被的盖玻片），置入37℃、5%CO2培养箱培养，定期用倒置显微镜观察细胞生长情况 ，隔日更换细胞培养液。

1.3.2 细胞的免疫化学染色：待细胞生长成单层后取出玻片，预冷的PBS漂洗，4%多聚甲醛室温下固定20min，PBS冲洗；3%的H2O2室温下孵育15min，PBS冲洗；10%的正常羊血清37℃封闭30min；加一抗（波形蛋白抗体、角蛋白抗体）稀释浓度为1∶200，4℃过夜孵育；二抗（SP标记的羊抗兔IgG）即用型工作液，37℃孵育30min；PBS冲洗，DAB显色；苏木精复染；盐酸酒精分色；中性树胶封片。阴性对照采用PBS代替一抗，其他步骤相同。高倍镜下计数100个细胞，计算细胞阳性率。

2 结果

2.1 形态学特征 倒置显微镜下观察基质细胞平铺生长呈单个分散细胞，在接种30min贴壁。细胞呈多角形或者梭形。多角形细胞胞浆薄而透明，有多个短小突起。消化后的腺上皮细胞呈管状或葡萄状，在接种24h后已贴壁。成团生长，培养2d后腺上皮细胞长成铺路石样的单层细胞集落排列紧密，细胞核大而圆，位于细胞中央。

2.2 细胞鉴定及纯度检测 采用对上皮细胞特异的细胞角蛋白18抗体和对基质细胞特异的波形蛋白抗体进行免疫细胞化学染色。子宫内膜腺上皮细胞角蛋白染色阳性，胞质被染成棕色，核呈蓝色，阳性率约96%（见图1，腺上皮细胞角蛋白－18染色阳性）。基质细胞波形蛋白染色胞质也呈棕色，阳性率达93%（见图2，基质细胞波形蛋白染色阳性）。

3 讨论

图1 腺上皮细胞（×200）

图2 基质细胞（×400）

本研究结果表明，运用挤压法和酶消化法相结合，可以成功地培养出围着床期小鼠子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。用挤压法［1］可以完整分离出围着床期小鼠子宫内膜。胶原酶Ⅰ消化作用温和缓慢，消化后获得的细胞比胰蛋白酶消化后获得的细胞活力高。本研究采用二者结合培养小鼠子宫内膜细胞，不但使子宫内膜细胞纯度提高，而且增加了细胞的活力。子宫内膜细胞由单层柱状腺上皮细胞和固有层基质细胞组成，两者相互作用，相互影响，腺上皮和基质细胞均受卵巢激素的影响产生周期性的变化，基质细胞具有旁分泌功能，其产生的酶类、功能蛋白和细胞因子调节子宫内膜腺体细胞的分化、增殖。Kleinman［2］研究表明基质是子宫腺上皮细胞生长、分化的必要条件，Arnold［3］提出基质细胞可能参与雌激素对上皮细胞的调节作用。所以将腺上皮细胞和基质细胞共同培养，以发挥两者的协同作用。对进一步研究小鼠子宫内膜细胞的生物活性和各种因素的调节作用以及建立与胚胎的共培养体系等具有重大意义。

［1］ 谭毅，顾美礼，王智彪，等.完整分离围着床期小鼠子宫内膜方法的建立〔J〕.中国实验动物学报，2001，9（1）：40－44.

［2］ Kleinman HK，McGarvey ML，Hassell JR，et al.Basement membrane complexes with biological activity〔J〕.Biochemistry，1986，25：312.

［3］ Arnold JT，Kaufman DG，Seppala M，et al.Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro：a new co－culture model〔J〕.Hum Reprod，2001，16：836.