甘露聚糖结合凝集素诱导DC成熟机制分析①

王凡平 王明永 杨建斌 赵东方 王红坡 邵 峰 孙瑞利 郭庆合 凌明智 赵永新宋士军 郭继强 (新乡医学院医学检验系，新乡453003)

甘露聚糖结合凝集素(Mannan-binding lectin，MBL)是由肝细胞分泌的血浆蛋白，为天然免疫系统中的关键分子［1］。近年来一些研究发现，MBL作为C型凝集素家族的重要成员和天然免疫中的关键分子，除了其固有的抗感染作用外，还发挥多种免疫调节作用［2-7］。陈月等［8］研究发现，MBL 能够诱导树突状细胞(Dendritic cell，DC)成熟，但机制并不明了。已报道，DC成熟过程中，模式识别受体Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)的表达发生改变;文献有报道，与MBL同为胶凝素家族成员的补体C1q能够通过核转录因子NF-κB信号途径诱导DC成熟［9］。MBL诱导DC成熟是否也与TLRs和NF-κB有关呢?需深入研究。

本研究以 TLRs和NF-κB为切入点，旨在初步探讨MBL诱导DC成熟机制。

1 材料与方法

1.1材料 人血浆天然MBL按文献［10］制备;rh-GM-CSF和rhIL-4购自Pepro-Tech公司。PE标记的鼠抗人CD1a、CD80及CD86单克隆抗体(mAb)，FITC标记的鼠抗人 CD83、CD86及 MHC-DR的mAb，同型 FITC-IgG1、PE-IgG1阴性参照抗体均为eBioscience公司产品。RPMI1640及尼龙毛柱购自Gibco公司;淋巴细胞分离液(Ficoll，密度1.077)为上海试剂二厂生产;新生牛血清(Newborn calf serum，NCS)购自杭州四季青生物工程材料研究所;鼠抗人 NF-κB mAb p65、抗 β-actin兔多克隆抗体及HRP-羊抗鼠IgG购自Sigma公司;鼠抗人MBL pAb购自R＆D公司;核蛋白提取试剂盒为Pierce公司产品，凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)测定试剂盒为Promega公司产品;［γ32-P］ATP为北京亚辉生物试剂公司产品;结合缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L CaCl2、2 mmol/L MgCl2、5 g/L BSA、1 g/L 叠氮钠;其它化学试剂均为进口或国产分析纯产品;FACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.2方法

1.2.1人外周血Mo的获取 取健康成人志愿者的外周血，肝素抗凝后，用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞。以PBS洗去血小板，于37℃贴壁3小时后弃上清，以37℃预温的RPMI1640轻洗去除非贴壁的细胞，刮取贴壁的黏附细胞即为Mo，用含10%NCS的 RPMI1640调整细胞密度为1×109个/L。

1.2.2DC的体外诱导 向Mo悬液中加入rhGMCSF和rhIL-4，分3组进行DC培养。常规组：只加rhIL-4和rhGM-CSF培养7天;MBL刺激组：培养5天后加入MBL(10 mg/L)继续培养2天;MBL+Anti-MBL刺激组：培养5天后加入MBL(10 mg/L)和Anti-MBL pAb继续培养2天;人血清白蛋白(HSA)刺激组(阴性对照)：培养5天后加入HSA继续培养2天。在诱导DC的过程中，每3天半量换液并补充相应的细胞因子，于倒置显微镜下观察细胞形态。7天后收集悬浮的细胞，分析DC的表型及功能。

1.2.3DC的表型分析 用预冷PBA(0.01 mol/L PBS+20 g/L BSA+0.1 g/L NaN3)洗涤不同实验组诱导7天后的悬浮细胞并调整细胞密度为5×109个/L。于100 μl细胞悬液中，分别加入两两组合的标记抗体，即 PE-抗 CD1a和 FITC-抗 CD83、PE-抗CD80 和 FITC-抗CD40、PE-抗 CD86 mAb 和 FITC-抗MHC-DR mAb各20 μl，同时设 PE和 FITC标记的小鼠IgG1抗体作为对照，于4℃避光标记30分钟后，用预冷PBA洗涤2次。最后用500 μl PBS悬浮细胞，于流式细胞仪上分析DC的表型。

1.2.4制备FITC-MBL 按照文献［11］，采用透析法，以FITC标记MBL，标记产物FITC-MBL的F/P比值为2.4。

1.2.5细胞结合试验 imDC用A缓冲液(调整Ca2+浓度分别为 1 mmol/L、5 mmol/L，或者用 5 mmol/L EDTA代替CaCl2)重悬并调整细胞密度为5 ×109个/L，于200 μl细胞悬液中加入 FITC-MBL，37℃避光反应30分钟。选择用人血浆MBL生理浓度的上限15 mg/L作为实验中MBL用量的标准浓度。

表1 引物序列及RT-PCR产物的大小Tab．1 Primer sequence and sizes of RT-PCR products

1.2.6RT-PCR分析DC TLR2、TLR4 mRNA的表达 细胞总RNA的制备：分别取上述体外诱导的各实验组1×107个细胞，用无菌PBS洗1次，按Trizol法操作指南提取总RNA。以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，用紫外分光光度仪测定其 OD260nm/OD280nm比值。统一调整总RNA浓度为0.15 mg/ml，立即反转录合成cDNA。PCR引物的设计与合成：参考文献［12］并经Primer premier 5.0软件分析，由上海博亚公司合成TLR2、TLR4和GAPDH等3对特异性引物(序列见表1)。GAPDH作为内参照。cDNA合成：分别取不同实验组DC总RNA各1 μg、5 × RT Buffer 4 μl、dNTP Mixture(各 10 mol/L)2 μl、RNase inhibitor(10 U/ μl)1 μl、Oligo(dT)20(10 pmol/ μl)1 μl和 ReverTra Ace 1 μl，加 RNase Free H2O至总反应体积20 μl。42℃反应20分钟合成cDNA第一链，99℃ 5分钟灭活反转录酶终止反应，4℃ 5分钟复性。PCR：反应体系为：10×buffer 2 μl、dNTPs 2 μl(各 0.25 mol/L)，上、下游引物各 1 μl(10 μmol/L)，模板 cDNA 1.5 μl，Taq DNA 多聚酶(5 U/μl)0.2 μl，加 DEPC 处理水至总反应体积20 μl。TLR2的PCR反应条件为：94℃变性30秒，60℃退火15秒，72℃延伸90秒，循环35次。TLR4的PCR反应条件为：94℃变性30秒，60℃退火25秒，72℃延伸1分钟，循环35次。GAPDH的 PCR反应条件为：94℃变性30秒，63℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环35次。取各PCR扩增产物5 μl于1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察、拍照，并用凝胶成像仪分析DNA片段的灰度值。

1.2.7EMSA和 Western blot分析 NF-κB细胞核移位 ①EMSA分析：按照Pierce公司提供的试剂盒说明书进行细胞核蛋白的提取，采用Bradford法检测提取液蛋白浓度，核蛋白-70℃冻存备用。根据Promega公司提供的EMSA检测试剂盒说明书进行各组细胞NF-κB活性的检测。探针的制备：分别按顺序取1.75 mol/ml NF-κB特异性核苷酸2 μl、10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液1 μl、3 000 Ci/mmol［γ32-P］ATP 1 μl、无核酸酶蒸馏水 5 μl和 5 ×103～1 ×104U/μl的 T4 多聚核苷酸激酶 1 μl，混匀后于37℃水浴中反应10分钟，加入0.5 mol/L EDTA 1 μl终止反应，并加入 89 μl TE 缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH7.9)，混匀置4℃保存。特异及非特异性竞争实验：在加入标记探针前，先加未标记的特异性探针(NF-κB寡核苷酸探针)，并逐渐增加未标记的探针浓度(特异性竞争实验);在加入标记探针前，先加入未标记的非特异性探针，并逐渐增加未标记的非特异性探针浓度(非特异性竞争实验)。于室温反应10分钟使探针与NF-κB结合，再进行PAGE。电泳后，取下凝胶制得干胶，于-70℃放射自显影12小时。②Western blot分析：5 μg细胞核蛋白提取物进行12%SDSPAGE，样品经SDS-PAGE分离后;恒压60 V转移3小时;转移后的PVD膜浸入含3%脱脂奶粉的PBST中封闭2小时;再将膜浸入1∶500稀释的鼠抗人NF-κB mAb p65中，室温反应60分钟;洗膜5次;加1∶1 500稀释的HRP-羊抗鼠IgG，室温反应60分钟。洗涤后以DAB显色试剂盒显色，终止反应，阴干后拍照。

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1.3统计学分析 应用SPSS13.0软件包进行统计处理，计量资料用

2 结果

2.1MBL对DC表面标志表达的影响 流式细胞仪分析(图1)发现，与常规组相比较，MBL刺激组中CD83+、CD86+和MHC-DR+DC的数量均显著增多，加入抗MBL pAb，MBL的刺激效应消失。

2.2MBL以Ca2+依赖方式结合imDC FCM分析表明，MBL在无Ca2+、或含EDTA的结合缓冲液中几乎不与imDC细胞结合，而在分别含1 mmol/L、5 mmol/L的结合缓冲液中，MBL与imDC的结合逐渐增强，呈Ca2+浓度依赖关系(图2)。

图1 不同刺激剂对DC表型的影响Fig．1 Effects of different stimulators on the phenotypes of DCs

图2 MBL以Ca2+依赖方式结合imDCFig．2 Ca2+-dependent binding of MBL with imDCs

2.3MBL对imDC TLR2、TLR4 mRNA表达的影响用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA显示28 S和18 S rRNA两条清晰带，紫外分光光度法测定总RNA样品OD260/OD280nm比值均大于1.8，表明提取的总RNA均具有较高的纯度和完整性。RT-PCR结果(图3)显示：PCR扩增产物为预期大小;随着DC的成熟，TLR2、TLR4 mRNA表达减少(Lane 2)，与常规组相比，MBL组减少的更加明显(Lane 4)，加入抗MBL pAb，MBL的作用效应消失(Lane 5)。

图3 MBL减弱imDC TLR2、TLR4 mRNA表达Fig．3 The decreased mRNA expressions of TLR2 and TLR4 in DCs by MBL

图4 MBL增强DCs NF-κB活性Fig．4 MBL enhancement of NF-κB activity in DCs

2.4MBL促进NF-κB活性 为进一步探讨MBL影响DC成熟的有关信号通路，我们又检测了MBL对核转录因子NF-κB的活性影响。EMSA结果显示：与常规组相比，MBL刺激能够显著增加imDC核转录因子NF-κB的DNA结合能力(图4A)，加入抗MBL pAb，MBL的作用效应消失;Western blot结果进一步证明，MBL刺激能够显著增加imDC核转录因子NF-κB由胞浆向胞核转位，加入抗MBL pAb，MBL的作用效应消失(图4B)。

3 讨论

作为专职APC，DC在启动获得性免疫应答中扮演着极其重要的角色。DC可以通过其模式识别受体(Patten recognition receptor，PRR)识别多种病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecule pattern，PAMP)，诱导DC成熟。PRR诱导的DC成熟不仅增强其激活T淋巴细胞的能力，而且增强DC本身产生免疫调节相关的细胞因子。作为一类重要的PRR，TLR分子不仅能够介导对病原微生物及其产物的识别，而且能够参与获得性免疫应答，被视为联系天然免疫和获得性免疫的桥梁。已有研究资料表明，imDC高表达多种TLR分子，如TLR2、TLR4，但是随着DC的成熟，TLR分子的表达逐渐降低，对于完全成熟的 DC，一些 TLR分子(如 TLR2和TLR4)的表达几乎检测不到。本研究结果显示，与常规组相比，MBL组DC TLR2和TLR4表达减弱更加明显，提示MBL确实有诱导DC成熟的功能。

许多研究结果证实NF-κB与DC的功能密切相关，它不仅决定了DC激活初始T淋巴细胞的能力，而且与多种炎性细胞因子的分泌有关(如TNF-α、IL-1、IL-6 等)［14-16］。作为一类重要的 PRR，TLR 介导的信号通路可以激活多种转录因子的表达，其中核转录因子NF-κB对DC成熟和细胞因子产生至关重要，随着DC的成熟，NF-κB活性明显增强，TLRNF-κB信号途径是影响DC成熟的极为重要的信号通路。我们研究发现，与常规组相比，MBL明显增强NF-κB的DNA结合能力和由胞浆向胞核转位的能力，提示MBL通过NF-κB信号途径来调节DC成熟的。

综上所述，MBL能够与DC表面分子直接相互作用，减弱DC表面TLR2与TLR4的表达，增强DC NF-κB活性，提示MBL能够通过调控 TLR/TNF-κB信号通路来发挥其调节DC成熟功能。

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