维生素E对约氏疟原虫感染BALB/c小鼠早期免疫应答的抑制效应

延 娟 刘 军 李 莹 潘艳艳 郑 丽 曹雅明 (中国医科大学基础医学院免疫学教研室，沈阳110001)

疟疾是疟原虫通过媒介昆虫蚊传播的人类最严重的寄生原虫感染性疾病。最新数据显示，目前世界上有109个国家发生疟疾流行，全球处于疟疾风险的33亿人群中，有2.7亿人患疟疾，其中将近100 万人死亡［1］。

维生素E(Vitamin E，VE)是细胞内和细胞外的抗氧化剂，其在抗寄生虫方面的作用多年来一直存有争议。早在上一世纪，人们就已经发现VE与免疫系统之间存在某种联系。有文献报道给动物补饲高水平VE后，可增强T淋巴细胞的增殖，促进吞噬细胞的吞噬作用，同时提高细胞因子产生和抗体水平，从而有利于疾病的恢复［2］。同时也有研究显示，VE可有效地增强新生儿的体液免疫应答，进而有效的抵抗新生儿期的感染［3］。

然而近年来，关于疟疾和VE的研究发现，饮食中补充VE可加重C57小鼠的脑疟症状;同时，在动物研究中发现，饮食中缺少VE可抵抗约氏疟原虫的感染。有文献报道，感染疟疾后红细胞膜表面的维生素E浓度降低，从而造成红细胞、疟原虫或者是疟原虫DNA的氧化破坏［4］;目前关于VE和疟疾之间的相关免疫机制尚不清楚。为此，本研究利用我们成功建立的P.y17XL易感鼠疟模型，动态地观察了VE对P.y17XL易感小鼠免疫应答的影响，以期明确VE在P.y17XL感染早期的免疫调节作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1实验动物、疟原虫及主要试剂 6～8周龄、雌性BALB/c小鼠由中国医学科学院实验动物研究所提供(许可证编号：SCXK京200420001);P.y17XL(日本爱媛大学分子寄生虫学教研室惠赠);PE-anti-CD69(clone H1.2F3BD Pharmigen)、FITC-anti-CD4(clone GK1.5，BD Pharmigen)、FITC-anti-CD11c(clone HL3，BD Pharmigen)、PE-anti-CD11b(clone M1/70，BD Pharmigen)、percp-anti-CD45R/B220(clone RA3-6B2，BD Pharmigen)、anti-TLR9(clone 5G5，hycultbiotech)和 PE-conjugated streptavidin(clone streptavidin，Biolegend)、FctⅢ/Ⅱ封闭抗体(clone 2.4G2，BD Pharmigen)、VE(sigma)。

无人机测绘技术一大优势是可以搭载高清摄像设备进行高空遥感拍摄作业。首先，在工程测量过程中，运用无人机测绘技术对工程项目周围的水文地质及地理情况等进行观测，通过无人机高清摄像设备进行航拍，影像具有更高的清晰度，分析数据更加可靠，监测内容更加全面。其次，无人机测绘技术能将拍摄图片放大，在遥感测量时，通过调控摄像软件系统，能够进行不同环境下的监测，从而使摄像过程中存在的误差问题得到更好的控制。最后，无人机测绘技术在工程测量中，机动性明显，搭载航拍设备或摄像系统能够很好地实现高清摄像，还可以定时定位监测设置，优化了无人机测绘的整体效果充分发挥其在工程测绘中的优势。

2.1两组小鼠感染后不同时间的原虫血症水平和生存率 如图1A所示，于感染后第2天，两组小鼠外周血中均出现疟原虫感染的红细胞。感染后第3天，原虫血症水平均为2% ～5%。随后，与NC组小鼠相比，VE组小鼠原虫血症水平显著升高，第6天时达到70%，同时如图1B所示，在感染后第6天VE组小鼠的生存率只有30%，而NC组的生存率达到70%。CD11b+DCs，mDCs)的数量 如图2A所示，与感染前相比，两组小鼠pDCs的数量于感染后第3天开始升高，于感染后第5天达到最高水平，然而，VE组小鼠脾pDCs的数量在感染后一直低于NC组，两者比较具有统计学差异(P＜0.05)。如图2B所示，mDCs从感染后第3天开始升高，并于感染后第5天达到最高水平，且在感染后第5天，两组之间具有统计学差异(P＜0.05)。

1.2实验动物感染BALB/c小鼠分别经腹腔感染1×106P.y17XL寄生的红细胞(pRBC)，感染不同时间小鼠经尾静脉采血，制备薄血膜，Giemsa染色，镜检计数红细胞感染率，并每日观察生存率。

每份样品用FITC-anti-CD4和PE-anti-CD69另设阴性对照管。预先加入FcγIIVII封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1 ml，再加入FITC-anti-CD4和PE-anti-CD69。离心去上清后，用0.5 ml细胞染色缓冲液重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测。

2.4两组小鼠感染后不同时间巨噬细胞(F4/80+)的数量 如图4所示，与感染前相比，NC组小鼠巨噬细胞数量从感染后3天开始升高，感染后第5天达到最高，而VE组小鼠巨噬细胞的数量和感染前相比，无明显变化。且与NC组相比，感染后3天、5天，VE组明显低于NC组(P＜0.05)。

通过对中老年糖尿病合并脑梗塞患者实施CT诊断后，取得显著效果，部分患者伴有意识障碍、失语、肢体瘫痪等情况，患者自身血糖难以控制，其病情易反复发作，导致患者病情严重，高血糖患者自身脑水肿情况十分严重，应对患者饮食密切注意，严格对饮食中糖类摄入有效控制，才能显著降低脑梗塞死亡性，通过控制患者血糖，对原发病实施积极治疗，具有显著效果，能改善中老年糖尿病合并脑梗塞患者的预后[4] 。

每份样品用FITC-anti-F4/80另设阴性对照管。预先加入FcγIIVII封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1 ml，再加入FITC-anti-F4/80，离心去上清后，用0.5 ml细胞染色缓冲液重悬浮细胞流式细胞仪进行检测。

每份样品用FITC-anti-CD11c PE-anti-TLR9另设阴性对照管。预先加入FcγIIVII封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1 ml，再用FITC-anti-CD11c标记，固定透膜后再用biotinylated anti-TLR9和 PE-conjugated streptavidin标记细胞。离心去上清后，用0.5 ml细胞染色缓冲液重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测。

1.3动物分组与药物处理 BALB/c小鼠随机分为2组：大豆油处理组(NC组)和VE处理组，600 mg/kg(VE组)，每组20只小鼠，分别于感染前10天连续每天一次灌胃大豆油或VE 0.2 ml。

1.5统计学分析 使用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，标本采用独立样本t检验对数据做统计分析，P＜0.05具有统计学意义。

图1 感染后不同时间原虫血症水平和生存率Fig．1 Parasitemia and survival rate of BALB/c mice in different time post infectionNote：A.Parasitemia;B.Survival rate.*.P＜0.05.

2.2两组小鼠感染后不同时间脾脏 DCs亚群(CD11c+CD45R/B220+DCs，pDCs 和 CD11c+

2 结果

随着人们生活水平的日益提高，人们对于精神生活也越来越重视。这时群众文化活动就成了他们首要选择的方式，其中群众美术文化成为人们追捧的群众文化活动之一。高水平的群众美术辅导活动有利于提高群众的审美能力。美术的发展经过了长时间的积累和进化，在传承和发展的同时，美术用它自身的魅力，影响着一代又一代的人们。高水平的群众美术活动可以丰富人们的生活，给人们带来心灵上的净化。

图2 感染后不同时间脾脏DCs亚群的数量Fig．2 The percentage of the subsets of DCs in different time post infection

2.3两组小鼠感染后不同时间脾脏CD11c+DCs细胞TLR9的表达水平 如图3所示，与感染前相比，两组小鼠TLR9的表达水平于感染后第3天、5天升高，然而，与NC组小鼠相比，VE组TLR9的表达无显著差异。

2.5两组小鼠感染后不同时间脾脏T细胞(CD4+CD69+T cells)的活化水平 如图5所示，与感染前相比，两组小鼠活化的T细胞的数量于感染后3天、5天均明显升高，且在感染后第5天两组之间具有显著性差异(P＜0.05)。

图3 感染后不同时间脾脏CD11c+DCs细胞TLR9的表达水平Fig．3 The percentage of CD11c+DCs expressing TLR9 in splenocytes in different time post infection

图4 感染后不同时间脾脏巨噬细胞的数量Fig．4 The percentage of macrophages in different time post infection

1.4流式细胞仪检测脾脏DCs亚群、巨噬细胞、TLR9的表达水平及T细胞的活化水平 无菌取出感染前(0天)和感染后第3、5天小鼠脾脏，常规方法制备脾细胞悬液，用0.17 mol/L NH4Cl裂解红细胞。以含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640调整脾细胞终浓度为1×107ml-1。每份样品用FITC-anti-CD11c、PE-anti-CD11b、percp-anti-CD45R/B220另设阴性对照管。预先加入FcγIIVII封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1 ml，再加入 FITC-anti-CD11c、PE-anti-CD11b、percp-anti-CD45R/B220，离心去上清后，用0.5 ml细胞染色缓冲液重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测。

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图5 感染后不同时间脾脏T细胞(CD4+CD69+T cells)的活化水平Fig．5 The activation of CD4+CD69+T cells in different time post infection

3 讨论

人体和动物模型研究结果均已表明：红内期疟原虫和固有免疫细胞之间的早期相互作用对于抗疟适应性免疫应答的建立至关重要［5，6］，因此，深入理解疟疾免疫的调节机制无疑具有重要的科学意义。

不同遗传背景的小鼠在感染同种疟原虫时，其免疫应答发生时相、强度明显地影响着感染进程和最终结局。我们前期的研究结果已经表明，BALB/c感染P.yl7XL后不能有效地建立Th1免疫应答，红内期疟原虫的爆发性增殖是BALB/c小鼠死亡的根本原因［7］。本实验结果表明，VE补充后，虽然死亡率没有明显变化，但其感染率明显高于对照组。由此提示VE补充后可进一步加重BALB/c小鼠的P.yl7XL感染。

目前，继电保护装置整机生产测试主要停留在手动测试或借助商用测试仪（如博电、昂立）和自主开发的测试仪进行的半自动测试阶段。无论哪种测试方案，整个测试过程都过于依赖测试工程师的参与：测试工程师要不断根据保护装置的类型选择测试线，并选择相关功能进行测试。缺点是测试过程复杂，劳动强度较大，测试时间稍长。为此，本文深入研究智能电网保护装置生产过程的各个子环节，通过对生产测试子过程的不断集成及优化，生产过程大数据的综合利用，整机测试仪的技术改进，气动系统的灵活控制等，设计了继电保护装置整机智能测试系统，实现了继电保护装置的智能化大生产测试。

有关文献报道，DCs明显决定着疟疾感染过程中Th应答的形式和效应强度［8］。本研究通过免疫调节剂VE对P.yl7XL易感小鼠BALB/c进行预先给药处理，发现作为活化初始T细胞的唯一抗原提呈细胞，两个重要细胞亚群活化均受到抑制，同时T细胞的活化也受到影响。

也有文献表明，DCs成熟和效应功能持续发挥的重要前提是TLR对于病原相关分子模式(PAMPs)的识别。研究表明，TLR9可通过识别疟色素诱导前炎症细胞因子的产生，同时上调共刺激分子，进而诱导DCs的成熟和分化［9］。然而，在本实验中补充 VE后两组小鼠TLR9的表达无明显差异。

除DCs外，大量研究表明，单核巨噬细胞明显影响着疟原虫的感染进程。巨噬细胞既可作为非特异免疫细胞发挥非特异性吞噬、杀伤作用，也可参与介导特异性免疫应答，发挥抗原提呈和免疫调节的重要作用。我们前期的研究结果已经证实，活化的巨噬细胞在约氏疟原虫感染早期遏制疟原虫在红内期的爆发性增殖，有效控制原虫血症的迅速上升［10］。然而在本实验中发现，与对照组相比，在感染后5天，VE组小鼠巨噬细胞的数量明显减少，且与感染前相比，补充VE后巨噬细胞的数量在感染后无有意义升高。由此提示，在疟疾感染中，VE预处理可有效抑制巨噬细胞的活化，从而影响机体对疟原虫的杀伤。

综上，VE作为一种免疫调节剂，在疟疾感染的过程中可通过抑制固有免疫应答，进而加重疟疾感染。

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9 Coban C，Ishii K J，Kawai T et al．Toll-like receptor 9 mediates innate immune activation by the malaria pigment hemozoin ［J］.J Exp Med，2005;201(1)：19-25.

10 潘艳艳，刘 军，李 莹et al．左旋精氨酸通过活化树突状细胞增强约氏疟原虫感染DBA/2小鼠的Th1应答效应［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2011;29(4)：247-251.