抗人DR5单克隆抗体诱导 Jurkat和 U937细胞凋亡的线粒体信号通路①

李淑莲 蔡 静 张舒曼 刘广超 马远方

(河南大学细胞与分子免疫学重点实验室河南大学免疫学研究所，开封475004)

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(Tumor necrosisfactorrelated apoptosisinducing ligand，TRAIL)为TNF家族的成员之一，TRAIL有5种受体，4种膜结合受体(TRAIL-R1/DR4、TRAIL-R2/DR5、TRAIL-R3/DcR1、TRAIL-R4/DcR2)和 1 种可溶性受体 OPG［1］，其中 TRAIL-R1/DR4 和 TRAIL-R2/DR5胞内段含有“死亡结构域(Death domain，DD)”［2，3］。TRAIL 与 DR4/DR5 结合后，能够激活死亡受体通路及线粒体通路诱导多种肿瘤细胞凋亡［4-6］，在临床试验中也显示出较好的抗肿瘤活性，但是肝细胞损害及一些肿瘤细胞对TRAIL诱导凋亡的抵抗等原因，一定程度上阻碍了 TRAIL的应用［7，8］。

近年研究发现，一些抗DR4/DR5的激活型抗体能够模拟TRAIL的作用，有效诱导肿瘤细胞凋亡，并且无 TRAIL 的肝细胞毒性［9，10］。本实验室成功研制一株抗人DR5激活型抗体-mDRA-6，前期实验表明，mDRA-6与细胞膜DR5结合，能够有效激活caspase-8等死亡受体途径信号分子，诱导多种肿瘤细胞凋亡［11］，但mDRA-6诱导肿瘤细胞凋亡过程中，是否有线粒体通路信号分子的激活尚不清楚，为了更全面研究mDRA-6诱导肿瘤细胞凋亡机制，本实验在白血病细胞系Jurkat和U937细胞上，探讨mDRA-6对肿瘤细胞线粒体通路信号分子的激活改变，为其临床抗肿瘤应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料 鼠抗人DR5单克隆抗体mDRA-6由本实验室制备;Jurkat细胞株由美国宾夕法尼亚大学医学院陈有海教授馈赠，U937细胞购于中国医学科学院上海细胞生物研究所;RPMI Medium 1640购于Gibco公司;胎牛血清购于天津TBD公司;四氮唑蓝(MTT)、DMSO购自Sigma公司;FITC-AnnexinV/PI试剂盒购自BD公司;Western细胞裂解液购自Beyotime公司;caspase-9抑制剂 Z-LEHD-FMK及caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK购于RD公司;山羊抗人 caspase-9抗体、兔抗人 caspase-3抗体购自R＆D公司;兔抗人Bcl-xl抗体购自Cell Signaling公司;兔抗人Bcl-2抗体、鼠抗人Bax、actin抗体购自Beyotime公司;山羊抗人Cytc单克隆抗体购自Santacruz公司;辣根过氧化酶标记羊抗鼠-HRP、羊抗兔-HRP及兔抗山羊IgG(H+L)购自北京中杉金桥公司;ECL显影试剂盒购自Amershem Pharmacia公司。PVDF膜购自Milipore公司;流式细胞仪(FACSCalibur)为BD公司产品;垂直电泳仪及电转装置为Thermo EC公司产品;凝胶图像分析仪(Alphalmager2200)为Alpha Inntech公司产品。

1.2方法

1.2.1mDRA-6对Jurkat及U937细胞生长增殖抑制作用 分别收集对数生长期的Jurkat和U937细胞，加入96孔培养板，细胞密度为3×104/孔，分别以不同浓度 (10、5、2.5、1.25、0.64、0.32、0.16 mg/L)的mDRA-6培养细胞10小时，或用终浓度为10 mg/L 的 mDRA-6 分别处理细胞 1、2、4、6、8、10小时。更换新培养液，加入MTT(5 mg/L)20 μl/孔，继续培养4小时。离心，吸弃上清，每孔加入150 μl DMSO，振荡混匀，全自动酶标仪测OD570值。每一实验浓度设3个复孔，实验重复3次。按以下公式计算细胞生长抑制率，细胞生长抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值) ×100%。

1.2.2DNA ladder检测mDRA-6对细胞的凋亡作用 调整Jurkat及U937细胞浓度为1×107/瓶，加入终浓度为10 mg/L的 mDRA-6，置于37℃ 5%CO2培养箱内孵育2小时，阴性对照为相同浓度的小鼠IgG1。收集细胞，800 r/min离心5分钟，弃上清，PBS洗细胞2次。提取细胞DNA，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外下观察并拍照。

1.2.3Western blot检测凋亡信号分子变化 取对数生长期的Jurkat及U937细胞，加终浓度为10 mg/L的mDRA-6，分别培养0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时后收集细胞，用预冷PBS洗细胞2次，加细胞裂解液(20 mmol/L HEPES pH7.5，0.35 mmol/L NaCl，20%甘油，1%NP-40，1 mmol/L MgCl2·6H2O，0.5 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L EGTA，1 mmol/L PMSF)冰上裂解30分钟，10 000 r/min离心15分钟，收集上清，用BCA法检测上清液蛋白浓度，取细胞总蛋白60 μg，进行SDSPAGE电泳，并转移PVDF膜。用含有5%脱脂奶粉的TBST室温封闭PVDF膜1小时，洗涤4次，分别加入抗人 caspase-9、caspase-3、bax、bcl-2、bcl-xl及Cyt c抗体，室温孵育2小时，洗涤4次。将膜封闭于HRP标记的二抗稀释液中，室温孵育1小时，TBST洗膜后，ECL反应液中反应1分钟，暗室显影。

1.2.4Caspase-9、3抑制剂对mDRA-6抑制细胞生长增殖的影响 收集Jurkat和U937细胞，接种于96孔板中，细胞密度为3×104细胞/孔，分别加入终浓度为15 μmol/L的caspase-9、3抑制剂，对照组加入同体积的 RPMI1640完全培养液。置37℃ 5%CO2培养箱内孵育1小时后，加入终浓度为10 mg/L的 mDRA-6，终体积为 200 μl/孔，置于37℃ 5%CO2培养箱内孵育8小时。每一浓度设3个复孔，实验重复3次。上述MTT法检测细胞生长抑制率。

1.2.5Caspase-9抑制剂对mDRA-6诱导细胞凋亡的影响 分别制备Jurkat和U937细胞悬液，加入24孔培养板，细胞数为3×105/孔，分别加入终浓度为15 μmol/L的 caspase-9抑制剂，终体积为1 ml/孔，对照组加入同体积的RPMI1640完全培养液。37℃孵育1小时后，加入终浓度为10 mg/L的mDRA-6，置37℃ 5%CO2培养箱内孵育细胞2小时。收集细胞，用结合液洗细胞2次，并将细胞悬浮于100 μl标记液中，加 FITC-AnnexinV/PI染液各5 μl，混匀后避光冰浴15分钟，流式细胞术检测细胞凋亡率。Cellquest软件分析细胞凋亡率。

1.3统计学分析 实验数据用±s表示，组间t检验进行统计学分析，P＜0.05认为有统计学差异。

2 结果

2.1mDRA-6对Jurkat及U937细胞生长增殖影响

不同剂量(10、5、2.5、1.25、0.64、0.32、0.16 mg/L)的mDRA-6孵育Jurkat及U937细胞10小时，两种细胞均呈现浓度依赖性地生长抑制;10 mg/L的mDRA-6也呈时间依赖性地抑制Jurkat及 U937细胞的生长增殖，10 mg/L的 mDRA-6孵育 Jurkat细胞6、8和10小时，细胞增殖抑制率分别达59.38%、72.56%和76.28%;10 mg/L的mDRA-6孵育U937细胞6、8和10小时，细胞增殖抑制率分别达38.67%、47.54%和50.59%，见图1。

2.2DNA ladder检测mDRA-6对Jurkat及U937细胞的凋亡作用 10 mg/L的mDRA-6作用Jurkat及U937细胞2小时，提取细胞DNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，mDRA-6处理的 Jurkat及U937细胞均呈现凋亡细胞所特有的DNA ladder条带，而对照组细胞无梯形图谱产生，结果见图2。

图1 mDRA-6对Jurkat和U937细胞的生长抑制作用Fig．1 Inhibition of mDRA-6 on Jurkat and U937 cells

2.3Western blot检测细胞凋亡分子 mDRA-6作用后，Jurkat和U937细胞内的凋亡分子发生变化。随着mDRA-6作用时间延长，Jurkat和U937细胞内的促凋亡分子bax激活增多，Cyt c释放增多，而同时细胞抗凋亡分子bcl-2及bcl-xl随mDRA-6作用时间延长不断减少。mDRA-6作用后，Jurkat和U937细胞内34 kD的caspase-9裂解片段明显增多;Jurkat和U937细胞caspase-3也显示明显的激活表现，Jurkat细胞 caspase-3激活尤为显著，10 mg/L的mDRA-6作用Jurkat细胞5分钟，Jurkat细胞caspase-3即有17 kD的裂解条带显示，且随着mDRA-6作用时间延长，12 kD的裂解片段明显呈现。结果见图3。

图2 DNA梯形条带分析Fig．2 DNA ladder analysis

图3 mDRA-6激活Jurkat及U937细胞凋亡分子Fig．3 Appototic molecule activation in Jurkat and U937 cells treated with mDRA-6

2.4Caspases-9、3抑制剂对mDRA-6抑制细胞生长增殖的影响 Caspase-9、3抑制剂能够不同程度降低mDRA-6对Jurkat和U937细胞的生长抑制作用。预先使用caspase-9、3抑制剂孵育细胞1小时，mDRA-6所致Jurkat细胞生长抑制率分别降低了24.36%(t=5.44，P＜0.01)和31.18%(t=7.97，P＜0.01);mDRA-6所致U937细胞生长抑制率分别降低了20.82%(t=4.29，P＜0.01)和50.20%(t=12.98，P＜0.01)。Caspase-9、3抑制剂单独使用，对Jurkat和U937细胞生长增殖无明显影响，结果见图4。

图4 Caspases抑制剂对mDRA-6抑制Jurkat及U937细胞生长的影响Fig．4 The effects of caspases inhibitors on cell inhibition ratio of Jurkat and U937 traeted with mDRA-6

2.5Caspase-9抑制剂对mDRA-6诱导细胞凋亡的影响 AnnexinⅤ/PI双染，流式细胞术检测结果表明，10 mg/L的mDRA-6作用Jurkat和U937细胞2小时，细胞凋亡率分别为66.64%和38.50%。预先用15 μmol/L的 caspase-9抑制剂孵育 Jurkat或U937细胞1小时，mDRA-6诱导的细胞凋亡率分别降低了32.89%和23.97%。15 μmol/L的caspase-9抑制剂对Jurkat和U937细胞无明显凋亡作用，结果见图5。

3 讨论

TRAIL与细胞膜上的相应受体(TRAIL-R1/DR4，TRAIL-R2/DR5)结合，启动胞外凋亡通路(死亡受体通路)和胞内凋亡通路(线粒体通路)，诱导多种肿瘤细胞凋亡。TRAIL与含有死亡结构域(Death domain，DD)的细胞膜DR4或DR5结合，通过衔接蛋白 FADD(Fas associated death domain，FADD)，激活caspase-8/caspase-10，启动外源性凋亡途径导致细胞凋亡［4，5］。

TRAIL胞内凋亡通路是线粒体依赖性的凋亡通路，受Bcl-2蛋白家族中促凋亡因子和抗凋亡因子相互调控，二者的平衡对于调节线粒体功能有重要价值。胞内凋亡通路主要的促凋亡成员Bax和Bak通过破坏线粒体膜的完整性发挥作用，bax是bcl-2家族的重要的促凋亡蛋白，在正常细胞中主要分布在胞质，在TRAIL等多种凋亡刺激因子的作用下，可以发生转位与线粒体相互作用，损伤线粒体造成线粒体膜电位变化，导致线粒体内某些促凋亡分子，如Cyt c等外流，进而活化caspase-9，激活效应caspases分子，启动细胞凋亡过程。抗凋亡成员bcl-2和bcl-xl在线粒体外膜发挥作用，bcl-2和bcl-xl可以和bax等结合形成异构二聚体，阻止bax对线粒体的损伤，以维持线粒体膜的完整性，抑制细胞凋亡。bax表达水平增加可拮抗bcl-2的作用，并促进细胞凋亡［12］。

图5 Caspases-9抑制剂抑制mDRA-6诱导的Jurkat/U937细胞凋亡Fig．5 Caspases-9 inhibitor inhibit the apoptosis of Jurkat and U937 cells treated with mDRA-6

研究表明激活型抗DR5抗体能够通过死亡受体通路，激活 caspase级联反应，启动细胞凋亡［13，14］。本实验中我们发现，激活型抗 DR5 抗体mDRA-6呈浓度、时间依赖性地诱导Jurkat和U937细胞凋亡，同时细胞内线粒体通路主要凋亡分子bax表达随mDRA-6作用时间而增多，而主要抗凋亡分子bcl-2及bcl-xl随mDRA-6作用时间而减少，提示线粒体通路可能参与了mDRA-6诱导的细胞凋亡，为了进一步明确线粒体通路的激活，我们应用Western blot方法，检测线粒体释放的凋亡因子Cyt c变化，结果发现mDRA-6作用Jurkat细胞15分钟，即可检测到Cyt c释放，并随mDRA-6作用时间延长而增多;mDRA-6作用U937细胞也显示有Cyt c释放增多。线粒体释放的Cyt c等凋亡因子，能够使细胞procaspase-9自身催化形成有活性的caspase-9，随后激活下游caspase-3等效应caspases分子，导致细胞凋亡。caspase-9激活是线粒体通路激活的重要环节，本实验中 Western blot检测发现，mDRA-6作用Jurkat及U937细胞后，细胞caspase-9、caspase-3均有激活片段产生，且预先应用caspase-9抑制剂能够有效抑制mDRA-6所致的Jurkat及U937细胞凋亡率，进一步表明线粒体通路激活是mDRA-6诱导Jurkat及U937细胞凋亡的重要机制之一。

抗人DR5的激活型单克隆抗体具有TRAIL的诱导肿瘤细胞凋亡作用，又克服了TRAIL的受体多样性及肝细胞毒性作用，可能较TRAIL有更好的抗肿瘤应用前景。本实验中的抗DR5单克隆抗体mDRA-6，能够有效诱导白血病Jurka及U937细胞凋亡，细胞线粒体通路激活是其诱导细胞凋亡的机制之一。对mDRA-6诱导肿瘤细胞凋亡机制的进一步研究，可能对提高mDRA-6抗肿瘤临床应用提供有用的理论基础。

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