黄连素对巨噬细胞清道夫受体表达的影响

黄周青，蔡雪黎，卢中秋，黄伟剑

（温州医学院附属第一医院，浙江 温州 325000，1.心血管内科；2.急诊科）

研究证实，氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）是动脉粥样硬化斑块形成的主要危险因子[1]，其明显增加单核源巨噬细胞CD36、LOX-1等的表达[2]。巨噬细胞通过清道夫受体如CD36、CD68、LOX-1或SRA等摄取oxLDL[3-6]，形成泡沫细胞。脂质负荷的泡沫细胞死亡，形成坏死的富含胆固醇的脂质核心，促进斑块不稳定，导致斑块趋向破裂。斑块破裂后，可释放出斑块脂质核心处的坏死组织，引起血栓形成和随后的动脉闭塞，从而引发急性冠脉事件的发生。可见，斑块内细胞泡沫化程度增加将大大不利于冠心病患者的转归。因此抑制巨噬细胞清道夫受体表达，减少oxLDL摄取，对动脉粥样硬化防治具有重要意义。近年研究发现黄连素（berberine）通过上调低密度脂蛋白（LDL）受体抑制细胞内脂质聚集[7]，且增加LXR α-ABCA1通路促进细胞内脂质的溢出[8]，提示黄连素在一定程度上可减少细胞泡沫化。但黄连素对巨噬细胞清道夫受体表达的影响尚不明了。因此，本研究从单核细胞向巨噬细胞分化过程及oxLDL刺激巨噬细胞模型分别揭示黄连素对清道夫受体表达的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素均购自GIBCO公司；佛波醇（PMA）为Calbiochem（San Diego，CA）产品；黄连素溶于二甲基亚砜（购自Sigma-Aldrich公司）；oxLDL购自北京协和医科大学生化室；FITC-CD36（NL07）、PE-CD68抗体（Y1/82A）购自Ebioscience公司；FITC-LOX-1抗体（23C11）为Hycult biotechnology b.v.公司产品；流式细胞仪为BD FACSCalibur产品。

1.2 细胞培养和细胞处理 人单核细胞株（THP-1）来自于ATCC公司（USA）。以5×105/mL密度培养于RPMI 1640+10% FBS+1%青/链霉素培养基中，置于5% CO2、37 ℃的培养箱中培养。以2×106/孔铺于六孔板，10% FBS RPMI 1640培养，加PMA（100 nmol/L）诱导48 h，促使其分化成巨噬细胞。然后换用低血清0.5% FBS RPMI 1640饥饿6 h，用黄连素（50μmol/L）预处理1 h后，加oxLDL（50μg/mL）刺激24 h，然后收集细胞检测各组细胞清道夫受体表达。欲观察单核细胞分化过程CD36的表达，实验共分三组：单核细胞组、PMA组（加PMA诱导48 h）和PMA+Ber组（加PMA诱导前予50μmol/L黄连素预处理1 h）。欲观察巨噬细胞受oxLDL刺激后的清道夫受体表达，实验分三组：巨噬细胞组、oxLDL组（加oxLDL刺激24 h）和oxLDL+Ber组（加oxLDL刺激前予50μmol/L黄连素预处理1 h）。

1.3 流式细胞仪检测 每次实验收集1×104个细胞用于流式细胞分析，按操作说明用流式细胞仪测定各组细胞清道夫受体CD36、LOX-1、CD68的荧光强度。

2 结果

2.1 单核细胞向巨噬细胞分化过程中，黄连素对清道夫受体CD36表达的影响 如表1所示，与单核细胞比较，巨噬细胞表面CD36表达量明显增加（增加约2倍），P＜0.01，而予黄连素干预后，CD36表达显著降低（P＜0.01）。

2.2 巨噬细胞受oxLDL刺激后，黄连素对巨噬细胞表面清道夫受体CD36、LOX-1及CD68表达的影响如表2，oxLDL组巨噬细胞表面清道夫受体CD36、LOX-1和CD68表达明显升高（P<0.01），黄连素处理可抑制巨噬细胞表面CD36、LOX-1的表达，但对CD68的表达无明显影响（P>0.05)。

表1 单核细胞分化为巨噬细胞过程中，黄连素对CD36表达的影响（±s）

表1 单核细胞分化为巨噬细胞过程中，黄连素对CD36表达的影响（±s）

与单核细胞组比：aP＜0.01；与PMA组比：bP＜0.01

CD36平均荧光强度1.05±0.07 3.09±1.10a 2.24±0.14b组别单核细胞组PMA组PMA+Ber组

表2 各组巨噬细胞清道夫受体（CD36、LOX-1、CD68）平均荧光强度比较（±s）

表2 各组巨噬细胞清道夫受体（CD36、LOX-1、CD68）平均荧光强度比较（±s）

与巨噬细胞组比：aP＜0.01；与oxLDL组比：bP＜0.01

CD36 5.9±0.35 12.65±0.57a 9.85±0.78b组别巨噬细胞组oxLDL组oxLDL+Ber组LOX-1 10.75±0.76 14.74±0.88a 11.51±0.58b CD68 9.34±0.85 24.83±1.63a 25.4±1.35

3 讨论

CD36是一种分子量为88 kD的膜糖蛋白，在单核/巨噬细胞、血小板、内皮细胞表面均有表达，它以高亲和力与oxLDL结合[9]，促进巨噬细胞吞噬oxLDL，诱导泡沫细胞形成；同时，被结合的oxLDL使细胞表面CD36表达上调，形成正向反馈。若CD36表达缺陷或受抑制，可减少巨噬细胞对oxLDL吞噬[10]。有研究[11]表明，他汀类（如atorvastatin）抑制单核源巨噬细胞清道夫受体CD36表达，减少细胞对oxLDL的摄取，提示抑制CD36表达可有效减少泡沫细胞形成。张社兵等[12]也报道，普罗布考抗动脉粥样硬化机制之一就是抑制oxLDL诱导的CD36表达。可见，清道夫受体CD36在巨噬细胞内促进脂质聚集方面扮演重要角色，抑制CD36的表达将成为干预泡沫细胞形成的靶点之一。我们既往的研究发现，黄连素具有抗动脉粥样硬化炎症的作用，如减少基质金属蛋白酶及其诱导因子的表达、抑制细胞核转录因子NF-κB、MAPK等信号通路的激活等[13]，然而，黄连素对巨噬细胞CD36表达的影响却鲜见报道。本研究发现，黄连素不仅能抑制单核细胞分化成巨噬细胞过程CD36的表达，同样也抑制oxLDL刺激后巨噬细胞CD36的上调，提示黄连素减少巨噬细胞吞噬oxLDL，抑制泡沫细胞形成的分子机制至少一部分是通过抑制受体CD36表达实现的。

受体LOX-1在血管内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞中均有表达[14]。它结合吞噬oxLDL，促进单核源巨噬细胞、平滑肌细胞向泡沫细胞转化。LOX-1基础表达很低，但是，一旦受致炎症因子（如TNF-α、oxLDL等）刺激后细胞表面LOX-1表达迅速上调；且在高血压、糖尿病或脂质代谢异常等体内环境下，LOX-1表达也明显增加[2]。由于大多数高血压、糖尿病、高脂血症以及炎症均直接或间接的与动脉粥样硬化形成有关，所以他们的存在对LOX-1调节可起协同效应。可见，LOX-1促进动脉粥样硬化进展的重要作用不容忽视[2，15]。而CD68是巨噬细胞表面的另一受体，体外实验已明确证实CD68能结合oxLDL[16]，因此我们在本研究中同时观察了黄连素对oxLDL刺激的巨噬细胞LOX-1及CD68表达的影响，发现黄连素能降低巨噬细胞LOX-1的表达，但对CD68的表达无显著影响。

综上所述，黄连素减少巨噬细胞泡沫化的机制不仅与黄连素抑制CD36表达有关，也有赖于LOX-1表达的下调，但与CD68的表达无关。

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