沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位重组DNA诱导小鼠体液免疫有效剂量的探讨

饶品欢，石朝晖，李文姝，吕艳，陈向敏，朱珊丽，张丽芳

（1.温州医学院 微生物学与免疫学教研室、分子病毒与免疫研究所，浙江 温州 325035；2.平顶山市疾病预防控制中心 检验科，河南 平顶山 467000）

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）是一类通过黏膜感染，严格胞内寄生的原核细胞型微生物，不仅是发展中国家感染性致盲的主要原因[1]，也是引起人类性传播疾病的一种重要病原体。Ct持续性感染可导致女性慢性盆腔炎、不孕和异位妊娠等严重并发症，同时Ct生殖道感染还能提高HIV和高危型HPV传播的概率[2-4]。

抗生素对Ct生殖道感染具有很好的疗效，但不能改善已经发生的病变，同时由于无症状性衣原体感染普遍存在，给预防Ct的感染和并发症的发生带来很大困难。因此研制安全有效的疫苗是控制泌尿生殖道Ct感染的最好方法之一。Ct主要外膜蛋白（major outer membrane protein，MOMP）占Ct外膜蛋白的60%，是引起宿主免疫反应的主要靶抗原。抗原是诱导机体免疫反应的决定因素，而免疫剂量也影响免疫反应发生的强弱，由于表位是免疫反应的物质基础，我们前期工作构建了含T、B细胞表位的重组多表位Ct MOMP168[5]，本研究则探讨通过分子克隆技术构建成功的Ct多表位重组真核表达质粒（pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168）以DNA免疫方式诱导小鼠产生免疫应答的最适免疫剂量，为进一步研究pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168体内免疫学效应提供实验数据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 真核表达质粒pcDNA3.1（+）系Invitrogen公司产品；质粒pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168和Ct E血清型由本实验室构建或保存；限制性内切酶HindIII和XhoI均购自上海晶美公司；无内毒素质粒抽提纯化试剂盒（Endofree Plasmid Maxi Kit）购自上海吉泰新绎生物技术有限公司（QIAGEN公司产品）；HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗鼠IgA均购自联科生物技术有限公司（KPL公司产品）；DL2 000TMDNA Marker和DL10 000TMDNA Marker均为TaKaRa公司产品；核酸蛋白分析仪（美国Beckman公司产品）；Elx 800型全自动酶标分析仪（美国BioTek公司产品）；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 实验动物 6～8周龄BALB/c雌性小鼠[SCXK（沪）2007-0005]，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，并饲养于温州医学院实验动物中心SPF级饲养室。

1.3 pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168的制备 质粒的构建方法参照文献[5]。构建成功的pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168重组真核表达质粒，转化大肠埃希菌DH5α菌株（Stratagene产品），利用无内毒素质粒抽提纯化试剂盒抽提与纯化，通过HindIII、XhoI双酶切和PCR鉴定（扩增Ct MOMP168多表位特异性引物：上游引物为5’-GTCGACAAGCTTATGGGCGATAA TGAAAACCAGAG-3’，下游引物为5’-GTGGTGCTCGAG TTAGACTCCAATATATGG-3’），引物由北京三博远志生物技术有限公司合成。重组质粒鉴定正确后，于核酸蛋白检测仪测定质粒浓度。

1.4 动物免疫 BALB/c雌性小鼠随机分为4组，每组9只。根据文献[6]设计三个免疫剂量组，即50、100和150μg剂量组，同时设PBS对照组。免疫前24 h小鼠腿部肌肉注射0.5%的利多卡因100μL松弛肌肉，鉴定正确的pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168重组质粒溶解于PBS缓冲液中，分别以上述3个免疫剂量于小鼠股四头肌注射免疫，间隔2周，共免疫3次。PBS对照组注射同体积的PBS。于免疫后0、2、4、6、8周分别尾静脉采血，分离血清-20 ℃冻存备用；并于免疫0、1、3、5、7周取小鼠阴道冲洗液，100～200μL/只，-20 ℃冻存备用。

1.5 间接ELISA法检测小鼠血清特异性抗体IgG以本实验室制备的原核表达Ct MOMP168多表位重组纯化蛋白（制备方法参照文献[5]）作为检测抗原，用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.6）包被96孔酶标板，每孔包被检测抗原100μL（50μg/mL），4 ℃过夜，PBS-Tween 20洗涤后，加入100μL PBSTween20-BSA（pH 7.4），37 ℃封闭2 h，洗涤后，每孔加入100μL各组小鼠血清（1:100稀释），37℃ 1 h，洗涤后，每孔加入HRP-羊抗鼠IgG（1:2000稀释）100μL，37 ℃ 1 h，洗涤后以邻苯二胺（OPD）-H2O2室温避光显色15 min，加终止液（2 mol/L H2SO4）后，于酶标分析仪490 nm处读取各孔A490值。

1.6 间接ELISA法检测小鼠阴道冲洗液中特异性抗体sIgA 具体操作同上，以纯化的原核表达Ct MOMP168多表位重组蛋白为检测抗原，一抗为小鼠阴道冲洗液（100μL/孔），二抗为HRP-羊抗鼠IgA（1:2000稀释），其余同上。

2 结果

2.1 质粒pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168的抽提和鉴定 质粒pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168抽提纯化鉴定后结果见图1。重组质粒pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168（泳道2）较空质粒pcDNA3.1（+）对照（泳道1）有抬高，酶切出现168 bp目的片段和载体片段（泳道3），PCR扩增后同样出现168 bp的目的条带（泳道4），与预期目的基因片段大小一致，进一步测序后序列正确。核酸蛋白检测仪测定质粒浓度为1.2 mg/mL。

图1 质粒鉴定图

2.2 免疫小鼠血清中Ct MOMP168特异性抗体IgG的检测 不同免疫剂量组小鼠血清中针对Ct MOMP168特异性抗体IgG的检测结果见图2。3个不同免疫剂量组，血清中特异性抗体IgG生成量于免疫第4周后均开始随免疫时间延长而逐步增加，3组不同免疫剂量组于4、6、8周抗体产生水平比较PBS对照组均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），其中150μg剂量组抗体IgG的产生优势显著，于4周（0.572±0.052）、6周（1.282±0.051）、8周（1.559±0.060)分别比较其他剂量组，差异均有统计学意义（P<0.05），显示了质粒DNA免疫时抗体的产生具有明显的剂量依赖关系。

图2 免疫小鼠血清中Ct MOMP168特异性抗体IgG的检测

2.3 免疫小鼠阴道分泌物中Ct MOMP168特异性抗体SIgA的检测 不同免疫剂量组小鼠阴道分泌物中Ct MOMP168特异性分泌抗体SIgA的检测结果见图3。结果显示，特异性抗体SIgA生成迅速，而且显示出剂量依赖性。免疫开始后1周，150μg剂量组SIgA的生成比较PBS对照组，差异有统计学意义（P<0.05），而100、50μg剂量组比较PBS对照组差异均不具统计学意义（P>0.05）。150μg剂量组免疫后1周、3周比较其他剂量组，差异均有统计学意义（P<0.05），5周时SIgA的生成达到峰值，7周后各免疫剂量组SIgA均开始下降，但150μg剂量组SIgA生成仍高于其他剂量组，差异均有统计学意义（P<0.05），而50μg剂量组比较PBS对照组，差异无统计学意义（P>0.05）。

图3 免疫小鼠阴道冲洗物中Ct MOMP168特异性抗体SIgA的检测

3 讨论

DNA免疫最大的优点就在于其进入体内后，疫苗抗原可以在靶细胞内以天然的方式被合成、加工并提呈给免疫系统，从而激发机体产生对疫苗基因产物特异性的CTL及抗体反应[7]。刺激机体免疫系统的方式与自然感染病原体的方式非常接近，这一特点对于构象型抗原表位引发保护性免疫尤为重要，因为目前重组技术在体外合成的蛋白质抗原常造成抗原表位的改变或丢失[8]。

由于Ct属于胞内寄生菌，目前临床上的治疗方法很难有效彻底清除体内的病原体[9]。Th1型免疫反应被认为是清除Ct生殖道感染的主要机制，尽管血清抗体IgG、IgA、IgE等可提供一定的保护作用，且在Ct再次感染中发挥重要作用，但多数情况下无法阻止感染的扩散和疾病恶化[10]。近年来研究发现生殖道局部的分泌性抗体SlgA在防御和清除Ct感染中更具有明显作用[11]，可阻断Ct对黏膜上皮细胞的黏附，从而阻断其对宿主细胞进一步的感染，还可通过抗体介导的调理作用增强巨噬细胞杀伤Ct的活性，或通过抗体依赖的细胞毒作用清除细胞内感染[12]。

本实验设计了3个常用免疫剂量，从Ct特异性抗体IgG及分泌性抗体SIgA的动态发生过程来确定最有效的免疫剂量。结果显示，3个不同免疫剂量组小鼠血清中Ct MOMP168特异性抗体IgG产生水平均随免疫时间延长而升高，其中150μg剂量组免疫开始第4周后，特异性抗体IgG生成量比较其他剂量组显著升高。免疫小鼠阴道分泌物中SIgA的产生较快，免疫开始1周后150μg剂量组SIgA的生成水平显著高于PBS对照组，且高于100μg剂量组。因此，pcDNA3.1（+）/Ct MOMP168免疫后，小鼠特异性抗体IgG和阴道冲洗液中分泌性抗体sIgA的产生水平均表现出显著的剂量依赖性，原因可能是高剂量免疫造成质粒吸收优势。最终，本实验为Ct MOMP168多表位重组真核表达质粒免疫小鼠确立了150μg的免疫剂量，为继续研究Ct MOMP168多表位质粒载体疫苗的免疫保护效应提供了有效可行的免疫参考剂量。

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